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1、 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析 院（系） 、所院（系） 、所 临 床 医 学 院 研究生姓名研究生姓名 曾 白 华 学科、专业学科、专业 临床检验诊断学 导 师 姓导 师 姓 名名 王 开 正 教 授 二一二年二一二年三三月月 2 目 录 摘 要 . 1 前 言 . 6 材料与方法 . 9 1 实验材料 . 9 1.1 标准菌株 . 9 1.2 实验菌株 . 9 1.3 主要试剂来源 . 9 1.4 主要试剂配制 . 10 1.5 主要实验器材 . 10 1.6 药敏纸片 . 11 2 实验方法 . 11 2.1 ESBLs 仪器初筛实验 . 11 2.2
2、 产 ESBLs 菌株表型确证实验 . 11 2.3 细菌保存 . 12 2.4 细菌复苏 . 12 2.5 细菌蛋白提取 . 13 2.6 细菌蛋白保存 . 13 2.7 制备样品混合液 . 13 2.8 芯片活化 . 13 2.9 上样 . 14 2.10 质量控制 . 14 3 质谱检测 . 14 3.1 检测标准化 . 14 3.2 质谱仪检测样本 . 14 3 4 数据采集 . 16 5 数据分析 . 16 5.1 ESBLs 菌株的蛋白质决策树诊断模型的建立 . 16 5.2 细菌蛋白质组学同源性分析 . 17 结 果 . 18 1 产 ESBLs 表型确证试验 . 18 2 肺炎
3、克雷伯氏菌蛋白质指纹图 . 19 3 肺炎克雷伯氏菌产 ESBLs 菌蛋白决策树诊断模型 . 21 4 聚类分析 . 24 4.1 聚类方法 . 24 4.2 32 株产 ESBLs 细菌聚类分析结果 . 26 4.3 49 株肺炎克雷伯氏菌聚类分析结果 . 27 讨 论 . 31 1 ESBLs 菌株检测方法及产 ESBLs 细菌的防治 . 31 2 细菌同源性分析的方法 . 32 3 蛋白组学鉴定细菌感染的同源性 . 34 结 论 . 36 致谢 . 41 缩略语名词对照 . 42 综述 . 44 1 肺炎克雷伯氏菌的蛋白质组学分析 摘 要 目 的 ： 利 用 表 面 增 强 激 光 解
4、析 离 子 化 飞 行 时 间 质 谱 技 术（SELDI-TOF-MS）检测临床感染的肺炎克雷伯氏菌蛋白质谱，对所得质谱数据进行决策树诊断和聚类分析， 为肺炎克雷伯氏菌产超广谱-内酰胺酶（ESBLs）菌株的鉴定和细菌同源性分析寻求简便快速的实验方法。 方法：1. ESBLs 仪器初筛实验（screening test） ：使用 walkaway-96 全自动细菌药敏鉴定仪对临床分离的肺炎克雷伯氏菌进行 20 种常见抗生素敏感实验，凡头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、氨曲南、头孢泊肟中有三种或三种以上显示耐药，仪器提示这些细菌为产 ESBLs 可疑菌株，应进一步做 ESBLs 确证实验。2. ES
5、BLs 表型确证实验(confirmatory test)：对初筛可疑产 ESBLs 菌株采用抗菌药物头孢他啶/克拉维酸（30g /10g）与头孢他啶抑菌圈差值，头孢噻肟/克拉维酸（30g/10g）与头孢噻肟抑菌圈直径差值来判断,当二种抗菌素中任何一种加克拉维酸后抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值5mm 时，判定为 ESBLs 阳性。以上两种试验均用肺炎克雷伯氏菌 ATCC700603 做质量控制。3.细菌蛋白质谱分析 对确证产 ESBLs 的菌株和不产 ESBLs 的肺炎克雷伯氏菌通过先破坏细菌、提取蛋白质，再用 SELDI-TOF-MS 技术及 Au 蛋白芯片自动检测细菌蛋白质指
6、纹图谱。 4.数据分析 对检测的细菌蛋白质图谱用 Biomarker Wizard 3.1 软件进行分析，筛选肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株和 ESBLs 阴性菌株相关差异表达蛋白，建立肺炎克雷伯氏菌 ESBLs 阳性菌株决策树诊断模型；用 SPSS 对肺炎克雷伯氏菌进行聚类分析，追溯其临床感染的同源性。 2 结果： 1.对 walkaway-96 仪器初筛产 ESBLs 的 33 株肺炎克雷伯氏菌通过纸片法表型确证实验确证有 32 株细菌 ESBLs 阳性（准确率为 96.97%） ，这些 ESBLs 阳性菌株主要分离自痰，其次是尿，患者以新生儿和 60 岁以上的老年人为主。 2. 3
7、2 株确证产 ESBLs 和 17 株不产 ESBLs 的肺炎克雷伯氏菌在相对分子量为 2000-20000 范围内共检测到 47 个蛋白质峰，产酶株和不产酶株有显著性差异的蛋白峰共 11 个（P0.01） 。3. 用三个质荷比分别为 5993.25，8363.60，9215.26 的蛋白质峰建立的肺炎克雷伯氏菌产ESBLs 菌株决策树诊断模型能够区分肺炎克雷伯氏菌产酶菌株和不产酶菌株，测试组准确率为 100%， 验证组准确率为 90.90%。 4. 32 株确证产 ESBLs肺炎克雷伯氏菌质谱指纹图通过聚类分析， 结果在差异水平为 10 的情况下分为五型（A 型、B 型、C 型、D 型、E
8、型） ，以 B 型为主，A 型次之,再其次是 C 型和 E 型，D 型最少，每型又分为 2-3 个亚型。 结论： 1.肺炎克雷伯氏菌产 ESBLs 菌株有其特征性的蛋白质谱指纹图。 2.筛选出的特征性蛋白质组（质荷比为 5993.25，8363.60，9215.26）建立的决策树诊断模型能够区分肺炎克雷伯氏菌ESBLs阳性菌株和ESBLs阴性菌株，从而快速指导临床用药的治疗决策。 3.肺炎克雷伯氏菌聚类分析结果与临床病人临床信息，是否产酶及药敏信息等基本一致，通过菌体蛋白质的分析能够有助于肺炎克雷伯氏菌临床感染的同源性判断。蛋白质组学方法，在细菌感染的同源性分析方面具有一定价值，值得进一步深人
9、研究并用基因分析或氨基酸序列分析进行验证。 关键词：肺炎克雷伯氏菌；蛋白质组； SELDI-TOF-MS ；决策树模型；3 同源性分析 Proteomic analysis of Klebsiella pneumoniae Abstract Objective: Using surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) to detect Klebsiella pneumoniae protein,adopting decision tree and cl
10、uster analysis analyse the obtained mass spectrometry data , to search for simple and fast experimental methods for the Klebsiella pneumoniae strains producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) infection and bacterial homology analysis. Method:1.ESBLs instrument screening test (screening test): analysing Klebsiella pneumoniae isolated from patients drug susceptibility by 20 kinds of c
