《适于人工饲料育和BmNPVBm表达系统的蚕品种品系筛选研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《适于人工饲料育和BmNPVBm表达系统的蚕品种品系筛选研究（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、捅要B E V S 是当前基因工程领域开发利用的四大表达系统之一，其中r B m N P v _ B m 表达系统在我国有着更大的发展优势，但在实用化方面还存在一些有待解决的问题：首先，利用该表达系统生产医用疫苗和蛋白类药物时，必须使用无菌蚕，需采用人工饲料无菌饲育：其次，重组病毒致病力弱，一般不能食下感染，目前只能采取单头微量注射的方法接种病毒，操作烦琐，工效低下，难以满足大规模生产的要求；第三，外源基因表达量受多种因素的影响，表达活性有待进一步提高。解决上述关键问题有多种途径，其中从宿主蚕品种的角度开展研究不失为一条捷径。为此，本研究以家蚕生物反应器的实用化为目的，以人工饲料养蚕为基础，主
2、要从三个方面筛选适于作为B m N P V - - B m 表达系统宿主的蚕品种，即对人工饲料适应性好、重组病毒食下感染率高、外源基因表达量高的家蚕品种。主要研究结果如下：1 调查了5 3 个蚕品种对人工饲料的综合适应性，结果表明不同品种的摄食性和适应性存在极显著差异。在所有供试品种中，以本专业新育成的春X 月( 9 7 3 X 9 7 4 ) 对人工饲料育的综合适应性最好，而且该品种产茧量高，其他经济性状优良，是今后推广人工饲料育的较理想的品种。我们培育的广食性品种杂A 与明珠的杂交种的综合适应性次之，杂A 是今后培育人工饲料育广食性品种的理想基础材料。除此之外，目前生产上推广的菁松皓月、9
3、 4 0 5X9 4 0 6 、皓月B 等也都是较适于人工饲料育的品种。2 不同蚕品种对含荧光增白剂V B L ( 重组病毒食下感染增效物质) 颗粒饲料的摄食情况存在极显著差异。供试品种中杂A 、月春( 9 7 4 X 9 7 3 ) 、9 4 0 5 9 4 0 6 、杂A 明珠、菁松皓月等品种都对含V B L 饲料表现出很好的摄食性。3 不同蚕品种在重组病毒食下感染方面存在极显著差异。对重组病毒食下感染率高的蚕品种有杂A 、菁松皓月、9 4 0 5 9 4 0 6 和月X 春等。4 重组病毒携带的外源基因在不同蚕品种体内的表达活性有较大差异，在注射感染的情况下差异极显著。在供试品种中，以杂
4、A 、9 4 0 5 9 4 0 6 、菁松X 皓月、月春和1 6 1 1 6 2 1 3 6 1 3 75 个品种外源基因表达量较高。5 通过对不同蚕品种小蚕期人工饲料育的适应性、全龄人工饲料育的适应性、对含荧光增白剂饲料的摄食性、对重组病毒的食下感染率以及外源基因在蚕体内的表达量等性状的多轮筛选，最后确定杂A 、春X 月( 月春) 、杂AV I明珠、9 4 0 5 X 9 4 0 6 、菁松皓月等5 个品种较适合作为B m N P V B m 表达系统的宿主。6 探讨了荧光增白剂V B L 对外源基因表达活性的影响及其增进感染的作用机理。结果表明，荧光增白剂V B L 在一定浓度范围内(
5、6 5m g 、5 7 5 - - 6 4 9m g 、5 - - 5 7 4m g 、 9 5 、9 0 一9 4 、8 5 - - 8 9 及 9 0 者，对人工饲料育的适应性为优，8 0 一8 9 为良，6 0 7 9 为中， 6 0 者为差。2 4 2 7 全龄人工饲料育适应性综合评价调查项目调查项目包括收蚁2 4 h 疏毛率、每龄眠蚕体重、每龄起蚕率、i 一3 龄存活率、4 龄存活率、5 龄存活率、5 龄盛食体重等。根据差异显著性分析，将每个蚕品种( 品系) 对全龄人工饲料育的适应性情况进行分类、排序。2 5 供试重组病毒及其构建携带酸性植酸酶基因的重组家蚕核型多角体病毒( r e
6、c o m b i n a n tB o m b y xm o r i n u c l e a r p o l y h e d r o s i sv i r u sc o n t a i n i n g p h y t a s eg e n e ，r B m N P V p h y ) ，由中国农科院蚕业研究所张志芳研究员提供。重组病毒构建过程如下：将从黑曲霉菌株A s p e r g i l l u sn i g e r9 6 3 克隆的植酸酶基因分别亚克隆到p V L l 3 9 3 转移载体，构建成植酸酶转移载体p V L l 3 9 3p h y ，通过与线性化B m B a c P
7、A K 6 D N A 同源重组，并经筛选，得到携带植酸酶基因的重组病毒。转移载体的构建如图l 。 2 6 重组病毒感染试验2 6 1 注射感染家蚕用人工饲料饲育至5 龄饷食2 4 h 后，随机挑取各品种蚕3 0 头，用微量注射器从蚕体中后部节问膜处，每头蚕注射1 0 1 0 6 p f u ( 5u1 ) 重组病毒，注射时尽量减少血淋巴的流失。注射后，将各品种蚕随机分为3 区，每区1 0 头，山东农业大学硕士学位论文F i g lC o n s t r u c t i o no f t h e t r m f e r v e c t o r p V L l 3 9 31 3王冰：适于人工饲料
8、育和B m N P V B m 表达系统的蚕品种筛选研究人工饲料正常饲育。至病蚕充分发病呈濒死状态时，收集血淋巴于e p p e n d o r f 管中。2 6 2 添食感染称取一定量V B L ( F l u o r e s c e n tW h i t e n i n gA g e n tV B L ，泰安市东岳助剂厂) ，用蒸馏水配成l 浓度的溶液。将一定量的病毒液加入配好的溶液中，混合均匀。称取一定量的颗粒饲料，加入饲料干物重1 6 倍的上述溶液，待溶液完全吸收后，饲喂家蚕。5 龄起蚕饥饿2 4 h 后，随机挑取各品种( 品系) 蚕3 0 头，分成3 区，每区1 0 头。每头蚕添食0
9、 3 9 颗粒饲料，3 0 u l 病毒液，约含6 l O S p f u 病毒粒子。至病蚕充分发病呈濒死状态时，收集血淋巴于e p p e n d o r f 管中。 2 7 植酸酶活力测定2 7 1 试剂配制( 1 ) l m o l L 醋酸溶液：1 1 4 4m 1 冰醋酸用d d H ：0 稀释，定容至2 0 0m l 。( 2 ) l m o l L 醋酸钠溶液：无水醋酸钠1 6 4 1 9 溶于1 5 0m l d d H 。0 ，定容至2 0 0 m l 。( 3 ) i m o l L 醋酸钠缓冲溶液：由上述两种溶液按固定比例配制而成，用酸度计校对最终p H 值。其它浓度的该
10、缓冲液由此稀释而成。( 4 ) 0 2 5 m o l L 植酸钠的乙酸一乙酸钠缓冲液( p H 为5 5 ) ：准确称取O 0 9 2 4 9 植酸钠溶于i 0 0m l0 。2 5m o l L 的p H 为5 5 的乙酸一乙酸钠缓冲液中，4 冰箱保存。( 5 ) 铁钼蓝显色剂：称取2 5 9 钼酸铵( ( N H 。) 6 M o ，0 。4 H ：O ) 用2 0 0 m l d d 心O完全溶解，加入8 m l 浓硫酸，搅拌均匀，再加入1 8 3 8 9 硫酸亚铁( F e S O 。7 H 。O ) ，用2 5 0 m i 容量瓶定容。( 6 ) 磷酸标准液：将磷酸二氢钾在1 0
11、5 。C 烘箱中干燥，并在干燥器中将其冷却至室温后，称取2 2 7 2 9 溶解于d d H ：0 中，并定容至l O O m l ，充分摇匀，配制成0 0 2 m o l L 的磷酸标准溶液。其它浓度的磷酸标准液均以此为母液用d d H 。0稀释而成。( 7 ) 1 0 三氯乙酸( T C A ) ：称取1 0 9 三氯乙酸，溶于9 0 m l d d H ：0 中。2 7 2 血样的制备取充分发病的r B m N P V 病蚕，用小剪刀剪破第一腹足，冰浴下用小型离心管每头蚕接收3 - - 5 滴血淋巴，加入终浓度为0 1 的苯基硫脲防止氧化，一2 0 1 4山东农业大学硕士学位论文保存备用
12、。2 7 3 植酸酶活力的测定( 1 ) 血样的稀释：取5 0 u l 血样，稀释于9 5 0 u l d d H ：0 中，混匀后，取2 0 u l稀释液，加入9 8 0 u l d d H ：0 ，充分混匀，血样既被稀释1 0 0 0 倍。( 2 ) 调整水浴锅温度为3 7 “ C ，取l O O u l 稀释成1 0 0 0 倍的稀释液于试管中，在水浴锅中预热5 m i n 。( 3 ) 加入9 0 0 u l O 2 5 m o l L 的植酸钠乙酸一乙酸钠缓冲液( 含l m M 植酸钠) ，从加第一个样开始计时，尽量加快加样速度。( 4 ) 水浴3 0 m i n 后，加入1 0 0
13、 0 u l T C A 终止反应，T C A 加入的速度应与加入檀酸钠乙酸一乙酸钠缓冲液速度保持一致。对照则在反应前先加入1 0 0 0 u l T C A ，然后加入9 0 0 u l 植酸钠乙酸一乙酸钠缓冲液。( 5 ) 反应被终止后，取出试管，加入2 m l 铁钼蓝显色剂，充分混匀显色。( 6 ) 用U V 一7 5 4 紫外可见分光光度计测定各试样7 5 0 n m 的吸光度。2 7 4 标准曲线的制作将0 0 2 M 的磷酸标准液，用d d H 2 0 依次稀释为：0 0 1 M 、0 。0 0 8 M 、0 0 0 6 6 J 、0 0 0 4 M 、0 O O E M 五种浓度
14、，每种浓度重复三次，按照上文测酶活的方法，省略3 7 。C 水浴3 0 m i n 。显色后测定各浓度的吸光度，制作标准曲线，Y = K X + B ，K 为斜率，B 为与Y 轴截距，计算K 值和B 值。2 7 5 植酸酶酶活力单位与计算通过标准曲线查得K 、B 的值。植酸酶活力单位定义为：3 7 “ C 下，p H5 5 0 条件下，每m i n 从植酸钠中释放出l u m o l 无机磷所需酶量为1 个酶活单位。C = K X A + B ，c 为血样中酶的浓度，A 为所测血样显色后的吸光度。E = C X1 0 3 X 稀释倍数+ 3 0 m i n ，单位为U m l ，E 为酶的活力
15、。2 8 荧光增白剂V B L 对家蚕中肠超微结构的影响电镜观察人工饲料育5 龄起蚕饥饿2 4 h 后，利用颗粒饲料添食1 浓度的荧光增白剂V B L ，取食3 6 h 后改正常人工饲料育，对照区不添食V B L ，其它处理相同。分别于添食V B L 后3 6 h 及改喂正常饲料4 8 h 时，解剖幼虫，剪取中肠中后部作为试验材料。将样品立即放入3 5 戊二醛溶液中前固定，0 1 M 磷酸缓冲液( P B S )冲洗，然后用1 锇酸后固定，0 1 M P B S 冲洗，梯度乙醇脱水，E p o n 8 1 2 环氧树王冰：适于人工饲料育和B r n N P V B m 表达系统的蚕品种筛选研究
16、脂浸透包埋、聚合。L K B 超薄切片机进行超薄切片，醋酸双氧铀一柠檬酸铅双染色，最后用J E M 一1 0 0 c xI I 型透射电镜观察拍照。2 9 数据处理本试验因涉及品种( 品系) 筛选，需要采用多种方法和手段进行大量的数据处理工作。试验中很多数据采用了百分数形式，尤其当百分数取值超出0 3 0 0 7 0 之外时，必须对原始数据进行数据转换，以稳定方差，使之近似服从正态分布，更准确的反映数据问的内在规律。本试验对此类需要转换的数据统一进行了反正弦转换，数据处理采用了S A S 软件进行。2 1 0 主要仪器设备名称Z R X 一1 0 0 0 D S W 型智能人工气候培养柜J E M 一1 0 0 c x 型透射电镜紫外可见分光光度记录仪S P X 型智能生化培养箱X D S 一1 1 3 倒置式生物显微镜超净工作台移液枪P H S 一3 C T 型P H 检测仪Z D
