《shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默》由会员分享，可在线阅读，更多相关《shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1shRNA 表达载体 pWH1 的构建及用于 HIF1 基因的沉默作者：吴元明, 张晓楠, 韩者艺, 李春英, 陈南春【摘要】 目的: 构建用于 RNAi 的 shRNA（small hairpin RNA）表达载体及检测其对低氧诱导因子 1（Hypoxia inducible Factor 1, HIF1）基因的沉默效果。方法: 从人血基因组中 PCR 扩增出 H1 基因启动子, 克隆入酶切处理后的 pEGFP C1载体片段中, 此载体命名为 pWH1。以人 HIF1 cDNA 基因为靶标设计引物, 退火后克隆入 pWH1。新的载体转染 SGC7901 细胞, 然后用 RT PCR 和 W
2、estern blot检测 HIF1 基因的表达改变。结果: 构建的 pWH1 载体能很好地表达针对 HIF1 基因的 shRNA, RT PCR 和 Western blot 的结果显示 HIF1 基因的 mRNA 和蛋白表达水平均明显下降。结论: 成功构建了 shRNA 表达载体 pWH1, 这对于基因的功能研究具有重要的意义。 【关键词】 shRNA 表达载体 RNA 干涉 HIF1 基因AbstractAIM: To construct the expression vector of small hairpin RNA（shRNA） and to test its efficacy
3、in silencing the Hypoxia inducible Factor 1 (HIF1)gene. METHODS: The H1 gene promoter was amplified from the genome of the human blood cells by PCR. Then the promoter was cloned into the pEGFP C1 vector digested with the restriction enzyme. The constructed vector was named pWH1. The primer was desig
4、ned to target the human HIF1 cDNA gene. The annealed primer fragment was cloned into pWH1. The new constructed plasmid was transfected into the SGC7901 cell line. Then the expression level of HIF1 gene was assayed by RT PCR and Western blot. RESULTS: The newly constructed plasmid expressed shRNA to
5、target the HIF1 gene.The results of RT PCR and Western blot showed the expression of HIF1 gene was reduced dramaticaly in mRNA and at protein level. CONCLUSION: The successful construction of shRNA expression vector (pWH1) provides a tool for further research into the function of a novel gene.2Keywo
6、rdsshRNA; expression vector; RNA interference; HIF1 geneRNA 干涉(RNA interference, RNAi)是将双链 RNA（dsRNA）导入细胞引起特异基因 mRNA 降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（PTGS）的一种。1998 年, Fire 等1在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现, 由正义和反义 RNA 退火形成的 dsRNA 引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义 RNA 强 10 倍以上。dsRNA 引起的基因表达抑制不是正义或反义 RNA 引起的基因表达抑制在数学上的叠加, 这就说明 dsRN
7、A 触发了细胞内的一些反应机制, 从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时, 他们就把这种现象命名为RNAi。RNAi 的应用谱非常广泛, 从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫, 其次就是果蝇。哺乳动物细胞的 RNAi 应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。Wianny 等2将 dsRNA 用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了RNAi。Sayda 等3用人工合成的 21ntRNA 二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了 RNAi。Brummelkamp 等4利用载体表达的 shRNA 在许多培养的人源, 猴源和鼠源的哺乳动物细胞的 RNAi 实验中取得了成功。在真核细胞内, R
8、NA 聚合酶 III 能指导短 RNA 的表达和 RNA 聚合酶 III 结合的启动子有 H1, U6 等。目前, 这两种启动子都被尝试作为表达短 RNA 的工具。本实验旨在克隆得到的 H1 启动子的基础上构建一个能稳定表达 shRNA 的真核载体。然后针对 HIF1 基因 mRNA 设计靶标, 在培养的 SGC7901 细胞（胃癌细胞系）内进行 RNAi 实验, 以观察新建的 pWH1 载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。1 材料和方法31.1 材料 pEGFP C1 质粒为 CLONTECH 公司产品; 各种限制性内切酶为NEB 公司产品。T4 连接酶
9、、 Pfu DNA 聚合酶和 DL 2000 DNA marker 为 TaKaRa公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。SGC7901 细胞由全军消化病研究所保存。Superscript II 反转录试剂盒购自 Invitrogen 公司; 兔抗人 HIF1 多抗、 兔抗人 actin 多抗和 Western blot Luminol Reagent 为 Santa Cruz 公司产品。Top10菌种由本实验室保存。1.2 方法1.2.1 以 pEGFP C1 为框架构建 shRNA 表达载体 pWH1 (1)用 Ase I 和 Mlu I双酶切, 去掉 pEGFP C1 质粒上 PCM
10、V, EGFP, MCS 和 SV40polyA 等片段, 剩余的部分作为构建 pWH1 的框架。在 Ase I 和 Mlu I 之间加上一个接头 DNA 序列, 该段接头 DNA 由下面 2 条引物退火形成（退火温度: 39.5）: 序列 1: 5 TAATGGAATTCGAAGCTTA 3; 序列 2: 5 CGCGTAAGCTTCGAATTCCAT 3。(2)通过 PCR 从人血细胞基因组 DNA获得 H1 RNA 基因 Promoter5。取新鲜血液 20 mL, 以 1300 r/min 离心 15 min, 取淡黄层细胞（白细胞）重悬于 15 mL 抽提缓冲液（10 mmol/L
11、TrisCl pH8.0, 0.1 mmol/L EDTA pH8.0, 20 mg/L 胰 RNA 酶, 5 g/L SDS）, 37温育 1 h。加蛋白酶 K至终浓度为 100 mg/L, 温和混匀。50水浴中放置 3 h。冷却至室温后, 用等体积酚和氯仿抽提后, 加入 0.2 体积 10 mol/L 乙酸铵和 2 体积的乙醇, 放置 30 min, 12000 r/min 离心 10 min。700 mL/L 乙醇洗涤 2 次, 空气中晾干。加入 1 mL TE(pH8.0)溶解 DNA, 此即人血细胞基因组 DNA。以此 DNA 为模板, PCR 引物为: P1: 5 CCATGGAA
12、TTCGAACGCTGACGTC 3(含 EcoR I 位点); P2: 5 GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC 3 (含Hind III, Bgl II 位点)。 PCR 产物通过 EcoR I 和 Hind III 两个酶切位点克隆入4pUC19 质粒, 进行序列验证。(3)pWH1 载体的构建: PCR 产物用 EcoR I 和 Hind III 双酶切, 克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pWH1。1.2.2 用 pWH1 进行沉默 HIF1 基因的表达 (1)以人 HIF1 cDNA 基因为靶标的引物设计: 选
13、取人 HIF1 cDNA 基因(GenBank 登录号: AF304431)中的 512530核苷酸为靶标, 设计两条引物。序列如下: 引物 1: 5 GATCCCCTGAAGTGTACCCTAACTAGTTCAAGAGACTAGTTAGGGTACA CTTCATTTTTG GAAA 3; 引物 2: 5 AGCTTTTCCAAAAATGAAGTGTACCCTAACTAGTCTCTTGAACTAGTTAGGGTACACTTCAGGG 3。(2)构建针对 HIF1 基因的 shRNA 表达载体pWH1 HIF1。将上面合成的两条引物用 TE（pH8.0）稀释成 0.5 nmol/L。各取 5 L
14、 混匀, 沸水中放置 10 min, 缓慢冷却至室温4-20保存备用。用限制性内切酶 Bgl II 和 Hind III 对质粒 pWH1 做双酶切。用 T4 连接酶对 pWH1 质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。铺于含卡那霉素的 LB 平板上, 37培养 24 h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶 EcoR I和 Hind III 对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pWH1 HIF1。 （3）转染胃癌细胞系 SGC7901: SGC7901 细胞用 RPMI1640 培养液（含 100 mL/L 小牛血清）在 37、 50 mL/L CO
15、2 条件下培养。转染前 24 h 将处于对数生长期的细胞重新接种于 6 孔板（瞬时）和 24（稳定）孔板中, 贴壁细胞在长满底面积 80%时进行转染。转染按照 LipofectamineTM2000 试剂说明书操作。于转染后 48 h 收集 6 孔板内细胞,做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后 72 h 按110 比例传代于 60 mm 直径培养皿中, 然后加入适量(4001000 mg/L)G418 进行筛选, 2 周后挑取单个细胞集落, 扩大培养, 然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)RT PCR 检测 HIF1 基因的 mRNA 水平: 待 6 孔板内细胞生长至底面积590%95%时,
16、 收集细胞。参照 Gibco 公司 TRIzol 试剂使用方法提取细胞 RNA, 溶于 20 L DEPC 水内。用 SuperScriptTM II RT kit 参照其使用说明进行 cDNA第 1 条链的合成。人 actin 内对照引物: P1: 5 GGCCGGGACCTGACTGACTAC; P2: 5 TCTTTGCGGATGTCCACGTC（长度 331 bp）。人 HIF1 RT PCR 引物: P3: GATCTCGGCGAAGTAAAG AATCTG; P4: AGAAAATTTCATATCCAGGCTGT（长度 680 bp）。PCR 反应条件: 95 1 min(94 40 s; 56 40 s; 72 40 s)26 cycle; 72 10 min; 4保存。(5)Western blot检测 HIF1 的蛋白水平: 已处理的转染细胞样品经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 100 伏转移 3 h 至 NC 膜上, 50
