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1、1CD158a 表达调节胃癌患者 CTL 细胞功能 的体外研究作者：刘振华, 陈晓耕， 林孟波， 黄毅【摘要】 目的 研究 CD158a 表达对胃癌 CTL 细胞体外功能的影响。 方法 利用免疫磁珠法分选培养表达与不表达 CD158a 的两型细胞，MTT 法测定其体外杀伤胃癌 MNK45 细胞的活性，Elispot 试验检测其分泌细胞因子的变化，RT PCR方法检测其 mRNA 的表达差异及 CD158a 受体激发后(Trigerring)的细胞毒 T 细胞凋亡情况。 结果 CD158a+ CTL 几乎不杀伤人胃癌 MNK45 细胞，但阻断相应CD158a 分子或靶细胞 MHC 1 分子后，杀
2、伤活性得到一定程度恢复。CD158a- CTL 以分泌 IFN 为主，参与 Th1 反应，而 CD158a+ CTL 主要分泌 IL 4，可能介导 Th2 反应。3 例胃癌患者的 CD158a+ CTL 细胞均可扩增出 300 bp 的 P58.2 cDNA 特征性条带。CD158a 分子激发后，CD158a+ CTL 凋亡细胞具有显著的形态学特征，DNA 电泳有典型的“ladder”梯型条带。 结论 CD158a 表达抑制胃癌CTL 体外杀瘤活性，影响其细胞因子的分泌，并在激发后诱导 CTL 细胞凋亡。 【关键词】 胃肿瘤 T 淋巴细胞 细胞毒性 杀伤细胞 天然 受休 细胞表面近年来，杀伤细
3、胞抑制受体(killer inhibition receptor, KIR)的发现丰富了学者对肿瘤免疫调节的认识。KIR 主要表达于人自然杀伤(NK)细胞和某些 T 淋巴细胞，其中的 CD158a 分子属于 P58.1 超家族，相对应人白细胞抗原(HLA)配基为HLA CW 2、4、5、6 血清型。通过与主要组织相容性复合物抗原类分子(MHC )结合，传递负性调控信号，在机体抗肿瘤免疫及移植排斥中发挥重要调节作用。2Gati 等研究表明，来源于肾癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒性 T 细胞(CTL)表面 KIR 分子可下调 CTL 杀瘤效能，认为 KIR 表达是 CD8+ CTL 免疫无能
4、的主要机制，揭示 CD158a 分子有助于免疫逃逸1。本研究旨在揭示 CD158a 表达对胃癌 CTL 细胞体外功能的影响。1 材料和方法1.1 胃癌患者 T 细胞表达 CD158a 测定 参照文献2的方法，分离 3 例患者 T细胞及诱导 CTL 细胞，采用直接免疫荧光标记技术，分别标记抗体FITC DX27(anti CD158a，IgG1，美国 Immunotech 公司)，设同型、同标记鼠抗人单抗作空白对照。检测 3 例患者的分离新鲜 T 细胞及其 CTL 细胞表达 CD158a 的情况。1.2 CD158a+ CTL 与 CD158a- CTL 的分选培养 利用有限稀释克隆技术，当阳性
5、孔克隆细胞生长到一定数量级(每孔 105 时，利用荧光标记单抗结合流式细胞仪检测其表型，标记后作相应培养、扩增，AIM V 培养基含 rIL 2 800 IU/mL(北京瑞得一合通公司)。每 35 d 换液 1 次，每周添加 1 次抗原及维持量的 rIL 2 (400 IU/mL)以维持 CTL 细胞活性。免疫磁珠法分选两型细胞，具体操作参见说明书(美国 Stem cells 公司)。1.3 CD158a+ CTL 与 CD158a-CTL 细胞的体外杀瘤活性 人胃癌 MNK45 细胞由苏州大学医学院张学光教授惠赠。体外杀瘤活性检测取效靶比(101)，MTT 法测定3，=490 nm，计算公式
6、为：杀伤活性(%)=(D 实验孔-D 阴性对照)/D 无杀伤对照100%每组设三复孔，实验中，只有靶细胞孔为无杀伤对照，效应细胞孔为阴性对照3孔。杀伤阻断试验选用单抗为抗 HLA A、B、C 单抗及抗 CD158a 单抗(即 DX27，美国 Pharmingen 公司)4。均以 5 g/mL 作用于相应细胞，37 孵育 2 h，以 PBS洗去未结合抗体，然后再测定相应体外杀伤活性。1.4 RT PCR 检测 CD158a 分子 mRNA 表达 应用 Trizol 试剂法提取CD158a+ CTL 细胞总 RNA，RT PCR 应用瑞士罗氏公司(Roche)生产的 Titan RT PCR 试剂
7、盒。KIR 引物的设计与合成参照文献5，委托上海生工公司合成。KIR(402 bp)：上游：5 TTCCCTCCTGGCCCACCCA 3下游：5 TCCCTGGATAGATGGTACA 3 actin(548 bp)：上游：5 GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3下游：5 CTCCTTAATGTCACGCACGATTC 31.5 CD158a+ CTL 与 CD158a-CTL 分泌 IFN 及 IL 4 的检测 采用 Elispot试验6, 略作修改。主要试剂均购自深圳晶美生物工程公司。抗 IFN 或抗人IL 4 单抗 15 g/mL 包被 96 孔酶联检测板(Nunc)，4 过夜
8、;洗板，CD158a +CTL与 CD158a-CTL 以含 10 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 液配成 1106 mL-1，每孔加 100 L 细胞悬液。加入自体 DC(DCT 为 110)100 L7，加入自体抗原 5 g/mL，设不加抗原作对照，每一处理设三复孔，37 、体积分数为 0.05 的 CO2培养过夜;加入 50 L 的生物素标记检测抗体(1 g/mL)，孵育过夜;洗板，加入 50 L 标记碱性磷酸酶的抗生物素蛋白(1.2 g/mL),室温置 2 h;洗板，每孔中加 50 L BCIP 底物溶液(美国 Sigma 公司)。显色适当时间，检测 IFN 需 1
9、h，IL 4 约需5 h;洗板，倒置显微镜下，低倍镜观察孔底，计数全部紫色斑点，以每 105 细胞形4成的斑点数表示产生细胞因子的细胞个数。 1.6 CD158a 分子激发后诱导 CTL凋亡观察1.6.1 细胞处理 CD158a+ CTL 与 CD158a-CTL 以 RPMI 1640 培养液洗涤，调整浓度为 2106 mL-1，种入细胞培养板(96 孔，英国 Greiner 公司)。每孔 100 L，加入 DX27 抗体(Anti CD158a，美国 Pharmingen 公司)10 g/mL;同浓度鼠抗人IgG2a 作对照;不作处理组视为自发凋亡组。37 下孵育 2 h 后，洗去游离抗体
10、，以 RPMI 1640 液重悬细胞备用。1.6.2 DNA 琼脂糖凝胶电泳 取细胞 2106 个，经裂解液(Tris HCl，pH 7.6)50 mmol/L、EDTA(pH 8.0)1 mmol/L、Triton X100 4 g/L 充分混匀，4 6 000 r/min离心 20 min。沉淀经 70%乙醇洗涤后溶于 20 L TE 缓冲液。1.5%琼脂糖凝胶电泳(电泳参数 5 V/cm)，电泳 3 h，紫外灯下观察电泳条带。1.6.3 AO/EB 染色 将细胞配成 3106 mL-1，于 25 L 悬液中加入 1 L 口丫啶橙/溴乙啶染液(AO/EB，各含 0.1 mg/mL),室温下
11、染色 15 min;在高倍荧光显微镜下(日本 NIKON 公司)计数活细胞和有异常染色质分布的细胞，AO 着染经历凋亡的细胞的细胞核，EB 着染死亡的细胞，活细胞不被染色;计数 200 个细胞,根据公式计算各组凋亡指数8,每次计数由二位操作者独立进行，取均值。1.6.4 凋亡细胞的 Annexin V/PI 染色 用 pH 为 7.0 的 Hepes/NaOH 缓冲液(含 140 mmol/L NaCl，25 mmol/L)0.1 mol/L 将细胞配成 1106 mL-1，取细胞悬液0.1 mL 加入 5 L Annexin V PE(美国 Pharmingen 公司)，再加 5 L PI(
12、50 g/mL，英国 Coulter 公司)。室温、避光染色 15 min;加 400 L 结合缓冲液终止反应，1 h 内 FCM 分析。AV+PI-为早期凋亡细胞，AV+PI+为后期凋亡的细胞或死细5胞，AV-PI-为活细胞。1.7 统计学处理 应用 SPSS 13.0 统计软件分析，组间均数差异用 t 检验，率检验用 2 检验。2 结 果2.1 胃癌患者 T 细胞 CD158a 表达 3 例患者分离新鲜外周血 T 细胞表面均可检测出 CD158a 分子，表达范围为 1%10%，与健康人外周血比较，差别无统计学意义(P0.05);而激活后的 CTL 细胞表达 CD158a 分子显著增多，与激
13、活前T 细胞表达率比较，差别有统计学意义(P0.01，表 1)。2.2 CD158a+ CTL 与 CD158a- CTL 体外杀瘤活性检测 CD158a+ CTL 对胃癌MNK45 几乎无杀伤活性，而 CD158a- CTL 表现了显著的细胞毒活性，两者比较差别具有统计学意义(P0.001);但在阻断 CD158a+ CTL 表面 KIR 分子或者阻断 MNK45 细胞 HLA I 类分子后，CD158a+ CTL 的体外杀瘤活性都得到一定程度恢复，说明 CD158a 分子削弱了 CTL 细胞毒作用(图 1)。2.3 CD158a 分子 mRNA 的 RT PCR 检测 3 例患者 CD15
14、8a+ CTL 中均扩增出 300 bp 大小的条带，而 CD158a-CTL 中未能扩增出相应条带，荧光强度与CD158a 表达率大小相一致(图 2)。2.4 CD158a+ CTL 与 CD158a- CTL 分泌细胞因子检测 每例实验重复 2 次，取均值。表中所列数值为总斑点数扣除对照组(未加抗原)斑点数，代表 105 个细胞中分泌相应细胞因子频数。CD158a+ CTL 以分泌 IL 4 为主，反映 Th2 型免疫反应6特征，而 CD158a-CTL 则以分泌 IFN 为特征，提示其介导了 Th1 型免疫反应(表 2)。表 2 CD158a+ CTL/CD158a- CTL 分泌 IF
15、N 及 IL 4 的检测2.5 CD158a 分子激发后诱导 CTL 凋亡研究2.5.1 DNA 琼脂糖凝胶电泳 P1、P3 CD158a+ CTL 与 DX27 抗体孵育 2 h 后，DNA 电泳表现出明显的梯形条带(“ladder”)改变，而对照(P1 CD158a+ CTL+对照IgG)则无“ladder”出现(图 3)。2.5.2 AO/EB 染色 各组细胞凋亡指数见表 3。3 例患者 CD158a+ CTL 细胞表面 KIR 分子被相应抗体(DX27)激发后，均出现了显著的细胞凋亡变化，与同一患者来源的 CD158a- CTL 相比较，差别具有统计学意义(P0.05)。表 3 AO/
16、EB 染色计算凋亡指数2.5.3 凋亡细胞的 Annexin V/PI 染色 利用 Annexin V/PI 染色法结合流式细胞仪方法检测，3 例患者 CD158+ CTL 细胞自发凋亡率为 0.9%(均值，下同)，与对照抗体孵育 2 h 后凋亡率为 3.6%，而与相应 DX27 抗体作用后凋亡率为 12.9%，与前者比较，差别具有统计学意义(P0.05)，说明 CD158a 分子激发后可诱导早期细胞凋亡事件。3 讨 论Yamada 等研究显示，健康个体外周血单个核细胞(PBMC)中的 T 细胞有4.6%14.7%表达 KIR 分子9，本研究测定胃癌患者分离新鲜 T 细胞的表达值与之相近。然而，T 细胞激活后 CD158a 表达显著增加，机制可能是：(1) T 细胞激活后，只表达 1 种或 2 种 T 细胞受体(TCR) 寡克隆扩增所致的非随机表达;(2) 持7续抗原刺激可维持 CD8+细胞表达 KIR;(3) KIR
