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1、1Rac1 在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义【摘要】 目的： 证实 Rac1 在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义，寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。方法： 特异性抑制 Rac1 蛋白表达的 siRNA 干扰肝癌高转移细胞株 97H，观察肝癌高转移细胞株 97H 内 Rac1 表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。结果： 肝癌高转移细胞株 97H 内 Rac1 表达、细胞生长受抑制，肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。结论： Rac1 表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭，可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。 【关键词】 Rac1 肝癌高转移细胞株 siRNA 移Abstract Object
2、ive: To prove Rac1 might play an important role in the proliferation and transference of hepatoma cell.Methods： small interference RNA technique was employed to knock down gene expression of Rac1 in hepatoma cell line 97H. Results： The protein level of Rac1, the cell proliferation, the cell vitality
3、 and the ability to invade the reconstituted basement membrane were decreased dramatically after transfection with a Rac1specific siRNA vector. Conclusion： Rac1 might play an important role in the development, progression,transference of hepatoma and also provide a possible strategy for the interfer
4、ence of tumor angiogenesis by targeting the Rac1.Key words Rac1; hepatoma cell; siRNA;transference肝癌的基因治疗正在不断探索中,表达调控治疗是肝癌基因治疗的重要策略。在先前的研究中我们发现肝癌细胞株 Rac1 的表达显著高于正常肝细胞株，提示Rac1 与肝癌的生长和转移有密切的关系1。本次研究我们运用 RNA 干扰技术，调控信号分子的表达，进一步证实 Rac1 与肝癌生长转移的关系，为肝癌的基因治疗寻找新的靶点。1 材料与方法21.1 材 料肝癌高转移细胞株 97H 由复旦大学附属中山医院肝癌研究
5、所分离和保存。LipofectamineTM 2000 购自 Invitrogen 公司；兔抗人 Rac1 购自 Santa Cruz 公司；鼠抗人的 actin 购自 RD 公司；HRP 标记山羊抗鼠二抗，HRP 标记山羊抗兔二抗购自 Biochemicol 公司；细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海申能博彩公司；PVDF 膜购自华舜公司；Costar TranswellTM 培养板（3422，孔径8m，直径 6.5 mm），购自 Corning 公司；Trigel Basement Membrane Matrix(356237, Phenol Redfree),购自 BD 公司；
6、siRNA 由上海化学基因公司合成。1.2 研究方法肝癌高转移细胞株 97H 用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液置于 37，5%CO2 的培养箱中培养。1.2.1 siRNA 合成 在基因库中查到人 Rac1 基因序列（编号是 NM_198829），输入到 RNAi 设计软件中，得到 4 个 siRNA 片段序列，选择特异性最好的三种加上文献报道的针对大鼠 Rac1 的一段序列，序列如下：1 号 siRNA：5UGUCCGUGCAAAGUGGUAUtt35AUACCACUUUGCACGGACAtt32 号 siRNA：5UCCUAUCCGCAAACAGAUGtt35CAUCUGUUUGC
7、GGAUAGGAtt33 号 siRNA：5CUUUGCAAAGACCUUCGUCtt35GACGAAGGUCUUUGCAAAGtt34 号 siRNA：5GUUCUUAAUUUGCUUUUCCtt335GGAAAAGCAAAUUAAGAACtt3上述 siRNA 由上海化学基因公司合成，分别为 5 nmol，另未知序列的对照siRNA 也购自上海化学基因公司。5 nmol siRNA 溶于 250 l 退火缓冲液中，分装后置于70冰箱保存。1.2.2 分组筛选 正常对照组为 c 组，对照 siRNA 为 0 组，此次设计的分别为1，2，3 组，文献报道的针对大鼠 Rac1 的 siRNA 为
8、 4 组。经中山医院钱成博士筛选，选定 2 号组作为本实验用 siRNA。1.2.3 LipofectamineTM 2000 介导的 siRNA 干扰 将细胞接种于六孔板，生长至60%80融合，干扰前 24 小时，PBS 洗涤两次，更换为不含抗生素的 DMEM 培养液 1 ml。再取 30 l 含 siRNA 的退火缓冲液加入 470 l OptiMEM；另取一离心管，分别加入 30 l LipofectamineTM 2000 和 120 l OptiMEM室温孵育 710 min。混合上述两种溶液（用倒转法），室温孵育 2025 min，溶液变混浊。此时再加入新鲜的 OptiMEM 溶液
9、 320 l，总容量调整为 1 000 l。将 1 000 l siRNALipofectamineTM 2000 加入前一天更换的无抗生素培养液中去，此时的siRNA 的终浓度为 50 nmol/L。6 h 后加无抗生素含 10胎牛血清的培养液至 3 ml/孔，两天后用于实验。1.2.4 蛋白提取和 Western blot 印迹 用 RIPA 加 PMSF 裂解细胞，BCA 法测定蛋白浓度，在基本保持蛋白上样量相等的情况下行蛋白电泳，半干后电转移至 PVDF 膜上，丽春红染色，剪下相应的蛋白条带，5%的脱脂奶粉封闭 4 h，加相应的一抗，4过夜，TBST 洗膜 3 次，再加相应的 HRP
10、标记的二抗，室温下孵育 1 4h，用 TBST 洗膜 3 次，加发光剂，ECL 发光检测。1.2.5 细胞生长曲线与细胞活力的测定 取干扰组、未干扰组、加入脂质体组的97H 肝癌细胞培养液接种于 96 孔细胞培养板上，培养 5 d。酶联免疫检测仪测定各孔光密度（D），绘制生长曲线。MTT 法分别测定 1，3，5 天的细胞活力，以光密度（D）表示。肿瘤细胞抑制率=对照组平均 D(495 nm)干扰组平均 D(495 nm)/对照组 D（495 nm)1.2.6 细胞体外侵袭能力测定 用 Transwell 小室进行细胞侵袭重建基膜实验。Matrigel 胶用无血清 DMEM 培养液稀释，加入到滤
11、膜上表面，室温下通风橱中干燥过夜。将干扰组、未干扰组、加入脂质体组的 97H 细胞用无血清培养液洗 3次，消化后重悬于无血清 DMEM 培养基中，取 5104/ml 细胞 100 l 加入至上室，600 l 10%小牛血清培养基加入下室。37，5CO2 条件下培养 20 h 后，去除滤膜上层细胞，取下滤膜，行 Gimsa 染色，镜下计数滤膜下表面细胞数，随机计数 5个视野中的细胞数目，每个标本重复 2 次，实验重复 2 次，求得平均数和标准差，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。1.3 统计学分析运用 SPSS 软件进行单因素方差分析。2 结 果2.1 经 siRNA 干扰后 97H
12、 肝癌细胞株 Rac1 蛋白表达5选择未干扰组和加入脂质体组做对照。图 1 显示在总蛋白上样量基本保持一致的前提下（actin 条带亮度基本相同），Rac1 在各组中的表达。可以看到 Rac1 在siRNA 干扰后的 97H 肝癌细胞株中的灰度明显低于对照组（未干扰组和仅加入脂质体组）。用 Alpha Imager 软件对感光胶片进行灰度分析，以目的条带（Rac1）与内参照（actin）的比值代表目的蛋白的表达水平，运用 SSPS 软件进行统计学处理，分析结果如图 2。可以看到 Rac1 条带在 siRNA 干扰后 97H 肝癌细胞株中与 actin 条带灰度值之比明显低于未干扰组和仅加入脂质
13、体组的灰度值之比。上述差异有统计学意义（P0.01）。2.2 siRNA 干扰后细胞生长曲线的变化siRNA 干扰后能显著抑制肝癌高转移细胞株 97H 的生长，记录第 1，2，3，4，5天的光密度（D）。绘出生长曲线（图 3）。第 5 天时干扰组细胞数约为对照组（未干扰组和加入脂质体组）的 70%，差异有统计学意义（P0.05）。图 3 各组细胞生长曲线Fig 3 Cell growth curve of each group2.3 经 siRNA 干扰后 97H 肝癌细胞活力的改变和 siRNA 对肿瘤细胞抑制率的测定与未干扰组和仅加入脂质体组相比，在同一时间点干扰组细胞活力显著下降，肿瘤抑
14、制率在 30%左右。表明 siRNA 干扰能显著抑制 97H 肝癌细胞株的活力和生长。62.4 肝癌细胞体外侵袭能力的改变siRNA 干扰后由于细胞内 Rac1 蛋白的显著减少，使细胞穿透 Matrigel 胶处理后的 Transwell 小室的能力下降。侵袭至 Transwell 小室滤膜下表面的细胞数每高倍视野干扰组为（28010.2）个，显著低于未干扰组（35012.4）个和仅加入脂质体组（3458.5）个，侵袭率和侵袭抑制率分别为 80%和 20%。 3 讨 论Rac1 是 Ras 信号途径的下游小分子蛋白，在不同细胞过程如基因表达、细胞运动、增殖和凋亡中起着关键性的调节作用。Rac1
15、 在一些肿瘤，如乳腺癌、结肠癌、睾丸细胞癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、胃癌中的表达均有增高2 -5。我们在先前的研究中也发现 Rac1 在肝癌细胞中的表达显著增高1。Xue 等6在对胃癌细胞的研究中发现， Rac1 特异的 siRNA 干扰胃癌细胞株，能高效抑制肿瘤细胞的增殖。他们的研究还表明，这种抑制作用可能是通过抑制血管内皮细胞生长因子的分泌来完成的。吴富明等7的研究提示 Rac1 与卵巢癌侵袭转移相关。现在已经明确的是 Rac1 与肿瘤基因的多个阶段有关，干扰 Rac1 的表达可能为肿瘤的基因治疗开辟新的策略。RNA 干扰技术是近几年发展起来的一项特异性抑制基因表达的方法 。RNA 干扰现象首
16、次在线虫中发现，不久，在真菌、植物、果蝇、锥虫、涡虫、水螅、斑马鱼等真核生物中都发现了 RNAi 现象。目前，在人、小鼠及其他哺乳动物中，RNAi已经被广泛用来进行基因功能的研究，同时 RNAi 技术作为一种基因治疗手段为人类战胜重大疾病带来希望。例如 2002 年 5 月，美国科学家 Lindenbach 等8报道，采用 21 个核苷酸双链 DNA 形成双链 RNA，加入到感染艾滋病病毒的细胞中，24 h 后，可减少艾滋病病毒基因表达 90以上。7RNAi 介导的转录后基因沉默是高效、特异的。可能作用机制是 siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上，并切割 mRNA，促使 mRNA 降解
