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1、1EPO 对失血性休克合并内毒素血症兔 TNF、IL6、IL10、MDA 影响的 研究【摘要】 目的观察内毒素血症引起兔脂质过氧化产物、炎症因子水平改变，运用促红细胞生成素(EPO)进行干预。方法兔股动脉放血造休克随后复苏，予腹腔注射内毒素，两次打击造成兔多脏器功能不全模型;24 只健康新西兰大白兔随机分成对照组、二次打击组、EPO 组，每组 8 只;造模前后留取血标本用于检测TNF、IL6、IL10、MDA 等指标。结果二次打击致其它两组 MDA 水平明显高于对照组，EPO 组 MDA 水平较二次打击组明显降低;二次打击致其它两组TNF、IL6、IL10 水平明显高于对照组，EPO 组明显低
2、于二次打击组。结论TNF ，IL 6，IL 10 等炎症因子与 MDA 等脂质过氧化产物参与了失血性休克合并内毒素血症所致多脏器损伤的过程，EPO 能降低失血性休克合并内毒素血症兔炎症因子及脂质过氧化产物水平。 【关键词】 内毒素血症;促红细胞生成素;多脏器功能不全;炎症因子Abstract： ObjectiveTo explore the rabbits lipid peroxidation and cytokine level change caused by endotoxemia，use EPO for intervention.MethodBleed rabbits femoral
3、for shock，after coming to，make injection of endotoxin，two beatings make dysfunctional multi organs model;randomly divide 24 healthy rabbits into control group(1)，2 beating group(2)，EPO group(3)，8 in each;take blood for testing indexes of TNF，IL6，IL10 and MDA.ResultGroup 2 was higher than other group
4、s on MDA level，group 3 less than group 2;group 2 was much higher than other 2 groups on TNF，IL6 and IL10，group 3 less than group 2.ConclusionThe cytokines and lipid peroxidation participating in the course of multi organ injury caused by blood loss shock and endotoxemia can be reduced by EPO.Key wor
5、ds： endotoxemia;EPO;dysfunctional multi organs;cytokines2严重的内毒素血症引起休克、DIC，甚至多器官功能衰竭(MODS)。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素，主要由肾脏皮质、髓质交界处的肾小管旁细胞分泌，分子量为 30.4kd。由于其具有促进造血的作用，在贫血治疗领域得到了广泛应用。鉴于 EPO 在细胞保护作用研究上的较大进展以及其抗炎作用的发现，本文设计此实验以观察 EPO 对失血性休克合并内毒素血症所致炎症因子水平及脂质过氧化产物表达的影响。1 材料与方法1.1 实验动物 新西兰大
6、白兔 24 只，雌雄不限，每只体重 1.92.5kg，由浙江省医学科学院动物实验中心提供。24 只新西兰大白兔随机分成 3 组：对照组 8 只，二次打击组 8 只，EPO 治疗组 8 只。1.2 实验试剂 重组人促红细胞生成素(rhEPO)(山东科兴生物制品有限公司)。内毒素试剂(LPS，E.coli，O111B4 )(美国 SIGMA 公司)。丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。兔肿瘤坏死因子酶联免疫分析(TNF ELISA)试剂盒(美国 USCN LIFE 公司，产品编号：E0133Rb)。兔白细胞介素 6 酶联免疫分析(IL 6ELISA)试剂盒(美国 USCN LIF
7、E 公司，产品编号：E0079Rb)。兔白细胞介素 10 酶联免疫分析(IL 10ELISA)试剂盒(美国 USCN LIFE 公司，产品编号：E0056Rb)。1.3 实验仪器 Spacelab 多功能监护仪(美国 Spacelab 公司)。Axsym 全自动发光免疫分析仪(美国 Abbott 公司)。BIO RAD 酶标仪(日本 BIO RAD 公司)。722光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)。LD4 2A 离心机(北京医用离心机厂)。-70超低温冰箱(美国 FORMA 公司)。HHW21.CU600 电热恒温水浴箱(上海医疗3器械七厂)。MM 1 型微量振荡器(江苏康泰医疗器械厂)。X
8、K95 B 旋涡混合器(江苏康泰医疗器械厂)。1.4 动物模型制备 二次打击(失血性休克合并内毒素血症)兔模型制作：参考卢瑗瑗等1的方法：兔耳缘静脉置留置针，氯氨酮(1.5mg/kg)肌注麻醉，麻醉后固定于手术台;(右股动脉区)股动脉置留置针，接换能器，连接监护仪，监测血压;测压正常后通过股动脉留置针连接三通快速抽出血液(肝素化室温无菌保存)，使兔 MAP 降至 40mmHg，维持 60min，随后回输全部血液及生理盐水使血压恢复至放血前水平，回输时间30min;复苏后予腹腔注射 100ug/kg 剂量 LPS(E.Coli O111B4)，20ml0.9%NS 稀释;通过股静脉留置针于造模前
9、，二次打击后 1h，二次打击后 6h，二次打击后 24h(处死前)取血标本;实验结束时取兔心肌组织标本，浸泡于 10%的中性甲醛液。1.4.1 对照组 分离股动静脉，置管后不予放血，90min 后腹腔注射20ml0.9%NS，于置管时及注射 NS 后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作 CKMB，cTnI，MDA，IL 6，IL 10，TNF 水平检测;处死兔，取出心脏标本作病理检测。1.4.2 二次打击组 按步骤制备二次打击兔模型，于造模前，二次打击后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作CKMB，cTnI，MDA，IL 6，IL 10，TNF 水平检测
10、;处死兔，取出心脏标本作病理检测。1.4.3 EPO 治疗组 按步骤制备二次打击兔模型，其中第 4 步在注射 LPS 结束4后，于耳缘静脉注射 5000iu/kg 剂量 EPO，于造模前，二次打击后 1h、6h、24h(处死前)取血标本，离心后取上清，作 CKMB，cTnI，MDA，IL 6，IL 10，TNF 水平检测;处死兔，取出心脏标本作病理检测。1.5 血清标本制备及保存 将血浆标本室温放置 2h 后，于 3000xg 离心 10min，取上清收集于锥形瓶中，将标本放于-70超低温冰箱保存。1.6 检测指标及检测方法 血清丙二醛(MDA)含量测定：硫代巴比妥酸(Thibabituric
11、 Acid TBA)法。血清肿瘤坏死因子(TNF )测定法：双抗体夹心法。血清白细胞介素 6(IL 6)测定法：双抗体夹心法。血清白细胞介素 10(IL 10)测定法：双抗体夹心法。1.7 统计学处理 本实验所有计量资料均采用均数标准差表示，数据资料用SPSS for windows 11.0 统计软件包处理，采用 F 检验进行多组间差异的比较，两两比较用 q 检验。 2 结果2.1 血清 MDA 测定 三组兔在造模前的血清 MDA 水平无明显统计学差异，二次打击组、EPO 组兔造模后各时间点血清 MDA 水平较对照组有明显上升，差异显著(P0.01)。EPO 组与对照组相比，造模后 1h M
12、DA 水平未显示出统计学差异，而在造模后 6h、24h 时，MDA 水平低于二次打击组(P0.05)。详见表 1。表 1 三组兔血清 MDA 测定结果(xs，mol/L)注：与对照组相比：# P0.01;EPO组与二次打击组比较：P0.05， P0.012.2 血清 TNF 、IL 6、IL 10 测定 三组兔造模前血清 TNF 水平未见统计学差异，二次打击组与 EPO 组造模后各时间点血清 TNF 较对照组明显上升5(P0.01)。EPO 组与二次打击组相比较，造模后 1h 两组血清 TNF 水平未见明显统计学差异，造模后 6h，EPO 组 TNF 水平较二次打击组下降(P0.05)，24h
13、 后下降尤为明显(P0.01)。详见表 2。表 2 三组兔血清 TNF 测定结果与对照组相比：# P0.01;EPO 组与二次打击组比较：P0.05， P0.01三组兔造模前血清 IL 6 水平未见明显统计学差异，造模后二次打击组与EPO 组各时间点血清 IL 6 水平较对照组明显上升(P0.01)。EPO 组与二次打击组相比较，造模后 1h 两者 IL 6 水平未见明显统计学差异，造模后 6h 及24h，EPO 组 IL 6 水平较二次打击组下降(P0.05)。详见表 3。表 3 三组兔血清 IL 6 测定结果注：与对照组相比：# P0.01;EPO 组与二次打击组比较：P0.05， P0.
14、01三组兔造模前血清 IL 10 水平未见明显统计学差异，造模后二次打击组与EPO 组各时间点血清 IL 10 水平较对照组明显上升(P0.01)。EPO 组与二次打击组相比较，造模后 1h 及 6h 两者 IL 10 水平未见明显统计学差异，造模后24hEPO 组 IL 10 水平较二次打击组下降，差异显著(P0.01)。详见表 4。表 4 三组兔血清 IL 10 测定结果(xs，ng/ml)n 造模前造模后 1h6h24h 对照组 80.160.020.170.010.190.020.160.01 二次打击组 80.160.010.320.03#0.650.09#1.020.05#EPO
15、组80.150.010.310.02#0.590.04#0.890.06#与对照组相比：# P0.01;EPO 组与二次打击组比较：P0.05， P0.013 讨论6内毒素血症是由于大量内毒素进入血液而引起的各种临床症状，多在感染、烧伤、休克等应激状态下出现。内毒素的生物效应是多方面互相促进或制约的，各种临床症状常是多种生物学效应综合作用的结果。虽然人们对内毒素的结构、生物学活性、致病机制以及内毒素血症的病理生理过程等方面的认识取得了显著进展，但是针对内毒素血症的治疗却没有很好解决。尽管采用了日臻完善的器官支持和重症监护技术，但严重感染及感染性休克的死亡率却一直居高不下。卞建民等2通过实验发现
16、失血性休克加重了以后发生的内毒素血症对宿主的危害性。大多实验证明，失血性休克会导致肠道黏膜屏障通透性增加，从而引起内源性细菌或内毒素易位3。但失血后肠道内毒素易位的程度还与动物种属有关，Jiang 等3发现大鼠在失血性休克后 30 min 可出现肠道细菌易位，90 min 时血液中内毒素含量明显上升。而 Endo 等4报告临床病人发生失血性休克后 7 天血液内毒素水平仍在正常范围。失血后宿主网状内皮系统受抑制而导致清除内毒素水平下降。卢瑗瑗等通过家兔股动脉放血诱发失血性休克，随后复苏，待血压稳定后，腹腔注射内毒素，成功建立了内毒素血症导致包括心肌损伤在内的多脏器损伤模型。本实验参照这一模型，两次打击体现复杂的病理生理过程，内毒素血症刺激机体炎症因子的大量释放损伤各脏器。MDA 反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。机体在内毒素作用下，激活氧化系统，抑制抗氧化系统，内毒素诱导
