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1、1乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中 HBx、 MHBst mRNA 的表达及其意义作者：于艳, 张 静*, 王汉民, 陈 威,洪柳, 刘彦仿 刘宏宝【摘要】 目的: 检测乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBVGN）肾组织中乙型肝炎病毒X 基因（HBx）及截短型乙型肝炎病毒表面抗原（MHBst）mRNA 的表达, 探讨HBx、 MHBst 在 HBVGN 发生中的意义。方法: 采用原位杂交的方法对 40 例HBVGN 患者的肾组织进行 HBx、 MHBst mRNA 检测。结果: HBVGN 患者肾组织中存在 HBx、 MHBst mRNA, HBx、 MHBst mRNA 主要分布于肾小管上皮细胞的胞质
2、内, 少数肾小球上皮、 内皮、 系膜细胞的胞质内也有分布; 肾小管上皮细胞内 HBx、 MHBst mRNA 阳性率分别为 82.5（33/40）、 80（32/40）, 肾小球内 HBx、 MHBst mRNA 阳性率分别为 30（12/40）、 22.5（9/40）, HBx、 MHBst mRNA 在肾小管上皮细胞的表达明显高于肾小球（P0.01）。结论: 在HBVGN 肾组织, 特别是在肾小管上皮细胞的胞质存在 HBx、 MHBst mRNA 的表达, 提示 HBV 感染及其基因整合可能在 HBVGN 发生中有一定意义。 【关键词】 乙型肝炎病毒相关性肾炎; HBx; 截短型乙型肝炎病
3、毒表面抗原; 原位杂交乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染在我国高发, 由其所引发的乙型肝炎病毒相关性肾炎（hepatitis B virus associated nephritis, HBVGN）较常见1, 但目前有关 HBVGN 的发病机制尚不十分清楚。既往研究发现肾小球内存在 HBV 的完整病毒颗粒（Dane 颗粒）或类似病毒的颗粒2; 在肾小球内及肾皮质中检测出游2离和整合的 HBV DNA 和 mRNA, 提示 HBV 在 HBVGN 肾组织（以肾小管上皮细胞为主）内存在复制3, 对肾组织可能具有直接作用, 但在此方面尚未见到深入研究的报道。在肝脏研究中
4、, 发现第 19476 个氨基酸之间截短的乙型肝炎病毒表面抗原（Cterminally truncated middle size surface proteins, MHBst）和全长的X 蛋白（hepatitis B virus X protein, HBx）基因编码的蛋白均具有反式激活作用, 能够激活某些核转录因子, 使其发生核转位, 导致炎症的发生4。为此, 我们运用原位杂交方法, 对 40 例 HBVGN 患者的肾组织石蜡标本中 HBx、 MHBst mRNA的表达进行检测, 观察 HBV 在肾组织中的存在及复制情况, 以期探讨 HBV 在HBVGN 发病机制中的作用, 为临床 HB
5、VGN 的诊断和治疗提供依据。1 材料和方法1.1 材料 HBVGN 石蜡标本(40 例)收集自 1999-01/2005-10 西京医院院收治的住院患者 40（男 34, 女 6)例, 年龄 1468 岁, 病程 20 d10 年, 所有病例均经HBV 血清学检测证实存在 HBV 感染, 并在 B 超引导下经皮肾穿刺活检术, 肾组织分别进行组织学、 免疫组化染色/免疫荧光及超微病理检查, 病理类型证实均为不典型的膜性肾病, 符合我国 1990 年制订的乙肝相关性肾炎的诊断标准5。设置 2 例血清 HBsAg 阳性的慢性活动性乙型肝炎患者肝组织为阳性对照; 阴性对照 8 例, 5 例为原发性膜
6、性肾病, 3 例为肾小球轻微病变, 均经常规肾活检及电镜诊断证实, 并结合 HBV 血清学及肾组织内免疫组织化学检测 HBVAg 等检查排除 HBV 感染及其他继发性膜性肾病。Taq DNA 聚合酶购自 Promega 公司; DNA 回收试剂盒购自优晶生物工程公司; 检测试剂盒购自 Roche 公司。1.2 方法31.2.1 引物设计与合成 根据 adr 亚型 HBV cDNA 基因序列gi: 32250975设计HBx、 MHBst DNA 探针的 PCR 引物, 引物由上海生工生物工程公司合成。1.2.2 PCR 反应及产物纯化 10Buffer 5 L、 10 mmol/L dNTP
7、4 L, 模板 DNA 3 L（除 MHBst 2 为 1 L）, 特异引物各 1 L, Taq DNA 聚合酶 0.5 L, 加 ddH2O至 50 L, 反应参数为 94预变性 5 min, 然后 94变性 30 s, 54复性 30 s（除MHBst 2 为 52）, 72延伸 40 s, 循环 30 次（MHBst1、 2 为 35 次）, 72再延伸7 min。PCR 产物琼脂糖电泳, DNA 回收试剂盒回收、 纯化 DNA 片段。1.2.3 地高辛标记 HBx、 MHBst DNA 探针 采用 DNA 随机引物法进行标记, 具体方法按地高辛 DNA 随机引物标记和检测试剂盒说明进行
8、。探针标记好后储存在 TE buffer (10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/L EDTA, pH7.4) 中, 2 个月内进行实验。1.2.4 HBVGN 肾组织切片的原位杂交前处理 新鲜载玻片和盖玻片冲洗、 泡酸、 高温烘烤, 以灭活 RNAase, 冷却后涂以 APES 避免组织脱片。在 DEPC 水处理下进行切片, 石蜡切片经常规脱蜡至水, 10 mL/L 过氧化氢室温处理 10 min 后用100 L 新鲜配制的胃蛋白酶溶液（0.01 mol/L 柠檬酸稀释）37消化 40 min。1.2.5 HBx、 MHBst mRNA 原位杂交检测 每张切片加预杂交液 20
9、L, 置湿盒内 37 3 h; 吸弃预杂交液, 每张切片滴加杂交液 20 L（探针 HBx 1、 HBx 2 混合液, MHBst 1、 MHBst 2 混合液, 探针终浓度为 1 g/mL）, 盖上硅化的盖玻片, 将玻片置 80 15 min 后再置湿盒内 42 1618 h; 揭掉盖玻片, 分别用 2SSC、 0.5SSC、 0.2SSC 进行洗涤; 经 50 g/L BSA 37封闭 30 min 后, 滴加生物化鼠抗地高辛, 37反应 12 h, 0.5 mol/L PBS 洗 5 min2 次; 滴加显色液置暗处显4色 224 h, 镜下观察出现阳性后水洗, 逐级酒精脱水, 二甲苯透
10、明, 中性树胶封片。结果判定: 以细胞内出现特异性紫蓝色颗粒为阳性结果, 阳性颗粒可定位于胞质、 胞膜或胞核上。1.2.6 对照实验 设置慢性活动性乙型肝炎肝组织为阳性对照; 原发性膜性肾病、 肾小球轻微病变肾组织为阴性对照及不加探针的空白对照。1.2.7 统计学分析 采用 SPSS 13.0 统计软件处理进行 2 检验。P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 HBVGN 肾组织中 HBx mRNA 的表达情况 HBx mRNA 阳性信号呈紫蓝色颗粒, 主要位于肾小管上皮细胞的胞质内（图 1A）, 此外, 还见于少数肾小球上皮、内皮、 系膜细胞的胞质内（图 1B）; 40 例 HBVGN
11、肾组织中, HBx mRNA 在肾小管上皮细胞的表达阳性率为 82.5（33/40）; 肾小球阳性率为 30（12/40）。HBx mRNA 在肾小管的分布明显高于肾小球（P0.01, 表 1）。 2.2 HBVGN 肾组织中 MHBst mRNA 表达情况 MHBst mRNA 阳性信号呈紫蓝色颗粒状, 主要位于肾小管上皮细胞的胞质内（图 1C）, 还见于少数肾小球上皮、 内皮、 系膜细胞的胞质内（图 1D）; 40 例 HBVGN 肾组织中, MHBst mRNA 在肾小管上皮细胞的表达阳性率为 80（32/40）, 肾小球阳性率为 22.5（9/40）。MHBst mRNA 在肾小管的分
12、布亦明显高于肾小球（P0.01, 表 1）。2.3 对照组检测结果 慢性活动性乙型肝炎患者 2 例的肝组织 HBx、 MHBst mRNA 检测为阳性, 阳性颗粒分布于肝细胞的胞质内; 肾小球轻微病变和空白对5照染色结果 2 例均为阴性; 在 5 例原发性膜性肾病中有 2 例出现肾小管上皮细胞胞质 HBx、 MHBst mRNA 阳性。3 讨论HBV 感染可引发 HBVGN。有关 HBVGN 的发病机制目前尚不十分清楚, 现有较多研究发现提示 HBV 在 HBVGN 的发生中可能具有直接作用, 但均缺乏足够证据。HBV 基因组有 P、 C、 X、 preS/S 4 个编码区, 分别编码病毒聚合
13、酶、 HBc 和 HBe 抗原、 HBx 蛋白及 LHBs、 MHBs、 SHBs 3 种表面抗原。在肝脏研究中发现, 整合在细胞染色体上的 HBV DNA 通常可发生重组和部分缺失, 其preS2/S 的羧基末端存在不同程度的缺失, 即 MHBst。由于结构的改变, MHBst 具备内质网（ER）定位功能, 能够在 ER 中滞留, 而不像 MHBs 那样进入高尔基复合体而分泌, 正因如此, 第 19476 个氨基酸之间截短的 MHBst 和全长的 HBx 基因编码的蛋白均具有反式激活作用, 能够反式激活同源/异源的病毒/细胞转录调节序列, 对乙型肝炎的慢性化和促进肝细胞的转化有密切关系6,
14、7。我们应用原位杂交的方法检测了 HBVGN 肾组织中 HBx、 MHBst mRNA 的存在和分布情况, 结果证实 HBVGN 肾组织中确实有 HBx、 MHBst mRNA 表达, 主要分布于肾小管上皮细胞的胞质内, 此外, 还见于少数肾小球上皮、 内皮、 系膜细胞的胞质等处; 肾小管上皮细胞内 HBx、 MHBst mRNA 的阳性率明显高于肾小球（P0.01, 与文献报道 HBV DNA 和/或 mRNA 在 HBVGN 肾组织内的检测结果一致3, 9。由于我们检测的是石蜡标本, 存放时间长, 又经甲醛固定, 不可避免地存在 RNA 降解, 尽管如此, 我们的 HBx、 MHBst m
15、RNA 检测阳性率仍能分别达到 82.5、 80, 这一方面说明标记的探针敏感度较高, 另一方面也证6实 HBVGN 肾组织中有很强的 HBx、 MHBst mRNA 表达; HBV 病毒可能以肾脏细胞为宿主细胞（尤其是肾小管上皮细胞）进行转录、 复制8, 也进一步支持了HBV 可直接感染肾脏并原位复制而致病的观点, 从分子病理水平为探讨 HBVGN的发病机制提供了新的依据。此外, 我们还发现作为阴性对照的 5 例原发性膜性肾病中有 2 例出现肾小管上皮细胞的胞质 HBx、 MHBst mRNA 阳性, 但这 2 例患者的 HBV 血清学检查为阴性, 应用免疫组织化学方法在肾组织内也未检测出
16、HBV 抗原, 我们推测一方面可能是由于 HBV 感染后患者血清中 HBV 抗原滴度时高时低呈波浪式, 而血清中 HBV 抗原消长并不与组织中消长同步; 另一方面可能是由于 HBV mRNA 在组织内未翻译、 转录或者免疫组织化学的敏感性低于原位杂交。该结果也提示应用原位杂交检测肾组织内 HBV mRNA 结果更为可靠, 可提高诊断 HBVGN 的阳性率。【参考文献】1 Xu H, Sun L, Zhou LJ, et al. The effect of hepatitis B vaccination on the incidence of childhood HBVassociated nephritisJ. Pediatr Nephrol, 2003, 18(12): 1216-1219.2 崔 敏, 刘志红, 朱丽晶, 等. 激光分离检测肾组织病毒 DNA 在乙型肝炎相关性肾炎分子诊断中的应用J. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2
