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1、1Wee1GFP 在 CTL 介导的细胞毒效应中 的作用研究【摘要】 目的: 研究 Wee1 GFP 融合蛋白对胞毒 T 细胞介导的胞毒效应的影响。方法: 采用脂质体将融合基因 Wee1 GFP 导入鼠胰岛瘤细胞(NIT 1)并检测其表达。以转染 pWee1 GFP 和空载体的 NIT 1 为靶细胞, 采用 ELISA 凋亡试剂盒和乳酸脱氢酶法检测胞毒 T 细胞介导的细胞毒效应。结果: Western blot 检出Wee1 GFP 融合蛋白的表达。转染 Wee1 GFP 的靶细胞发生凋亡及损伤的细胞数比转染空载体的靶细胞少。结论: Wee1 GFP 基因转染靶细胞具有一定的抵抗CTL 介导的
2、胞毒效应的能力。 【关键词】 凋亡 Wee1 细胞毒效应近年来, 胰岛细胞移植治疗糖尿病正日益受到人们关注。无论是 1 型糖尿病还是 2 型糖尿病都存在胰岛 细胞的衰竭问题。在糖尿病的自然病程中, 胰岛 细胞功能的持续恶化是一个不可逆的过程, 采用胰岛细胞移植治疗糖尿病可能成为恢复胰岛 细胞功能以根治糖尿病的一个重要手段。然而组织来源不足限制了胰岛细胞移植的广泛开展,因而再造分泌胰岛素的克隆细胞并进行移植以重建胰岛细胞功能, 为糖尿病治疗提供新的研究方向, 而胰岛细胞移植同样面临免疫排斥的问题。杀伤性 T 细胞的杀伤机制在器官移植排斥反应发挥重要作用1, 本研究将 Wee1 GFP 基因导入胰
3、岛瘤细胞株 NIT 1 细胞, 以研究该融合蛋白在胞毒 T细胞介导细胞毒效应机制中的作用。1 材料和方法21.1 材料 MTT(Sigma 公司); 乳酸脱氢酶（LDH）底物溶液（Roche 公司）; ELISA 凋亡检测试剂盒（Roche 公司）; 脂质体 LipofectamineTM2000(Invitrogen); 核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物）; 重组质粒 pCMV Wee1/GFP（华中科技大学同济医学院免疫学系惠赠）; 质粒 pKEN GFP(本室保种); NIT 1 细胞株（小鼠胰岛瘤细胞株, 澳大利亚 WEH1 实验室惠赠, 本室保存）; 8 周龄 BALB/c 小鼠（暨南
4、大学医学院实验动物中心）。1.2 方法1.2.1 基因转染和筛选 将 NIT 1 细胞接种于 6 孔培养板, 细胞数 3105/孔, 培养 24 h, 80%细胞融合, 按 LipofectamineTM2000 试剂说明书方法将质粒pWee1 GFP 及空载体 pKEN GFP 分别导入 NIT, 转染后 48 h 加入 G418(500 mg/L)进行筛选, 并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况。转染pWee1 GFP 的 NIT 记为 NITwg, 转染 pKEN GFP 的 NIT 记为 NITg。1.2.2 Western blot 检测蛋白的表达 收集培养的 NITw g 细
5、胞和 NITg 细胞, 弃去培养液, 细胞用预冷的 PBS 洗涤 2 遍, 按照 KEYGEN Nuclear Cytosol Extraction 试剂盒提取细胞核蛋白质。采用兔抗人 Wee1 多克隆抗体进行 Western blot 检测 Wee1 的表达。1.2.3 效应细胞的制备 体外混合细胞培养制备效应性 T 细胞: 将 NIT 1 细胞（1109/L）用丝裂霉素 C 处理, 终浓度 30 mg/L, 37 1 h 后与小鼠脾脏单个核细胞（MSMC）于 24 孔板中混合培养（2 mL RPMI1640 培养液含 1107 鼠 MSMC, 1106 NIT 1 细胞, IL 250 U
6、/mL, ConA 5 mg/L）, 6 d 后收集淋巴细胞, 记为鼠TcA。体内外联合免疫小鼠制备效应性 T 细胞: 取 BALB/c 小鼠, 腹腔注射3NIT 1 细胞 2 次, 第 1 次注射 1107（0.5 mL）细胞, 间隔 2 周同量再注射 1 次, 5 d 后分离小鼠 MSMC 作为反应细胞。以丝裂霉素 C 处理的 NIT 1 细胞为刺激细胞, 按上法进行混合细胞培养, 6 d 后收集鼠淋巴细胞, 记为鼠 TcB。1.2.4 ELISA 检测细胞凋亡 以上述鼠 TcA 和鼠 TcB 为效应细胞, 以 NITwg和 NITg 细胞为靶细胞, 效靶比为 12.51, 按 ELISA
7、 凋亡检测试剂盒方法检测效应细胞诱导的细胞凋亡。以下列公式计算细胞释放的单或低聚核小体特别聚集值: 聚集因子=实验孔的 mU/对照孔的 mU; mU=双孔平均 A 值底物 A 值; 注: mU=吸收值(10-3)。1.2.5 LDH 法测定胞毒 T 细胞介导的细胞毒作用 以鼠 TcA 和鼠 TcB 为效应细胞, 以 NITwg 及 NITg 为靶细胞, 效靶比为 12.51 分别加入 96 孔板, 同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组, 采用乳酸脱氢酶（LDH）法进行检测, 根据公式计算细胞杀伤率: 细胞杀伤率=（实验组平均 A 值自然释放对照组 A 值）/（最大释放对照组 A 值自然释
8、放对照组 A 值）100%。1.2.6 统计学处理 本实验采取未配对资料的 t 检验进行分析。2 结果2.1 融合蛋白的荧光表达检测 细胞转染重组质粒 pWee1 GFP 后 48 h 用相差荧光显微镜观察, 可见 NIT 1 细胞内有绿色荧光蛋白表达（图 1）。图 1 转染 pWee1 GFP 的荧光表达检测（略）A: 转染 pWee1 GFP 的 NITwg 细胞; B: 未转染质粒的 NIT 细胞.42.2 Western blot 检测融合蛋白的表达 将 pWee1 GFP 和空载体分别导入NIT 1 细胞, 并通过 G418 筛选获得稳定表达细胞后, 采用 Western blot
9、分析融合蛋白 Wee1 GFP 的表达情况。转染融合基因 pWee1 GFP 的 NITwg 细胞可见特异性条带, 而转染空载体的 NITg 细胞则未见阳性条带（图 2）。图 2 Western blot 检测 Wee1 GFP 的表达（略）2.3 NIT 刺激前后淋巴细胞增殖的形态学变化 NIT 刺激前的淋巴细胞体积较小, 多分散存在, 未见细胞成团现象（图 3A）。NIT 刺激后的淋巴细胞（图 3B）, 混合 NIT 淋巴细胞培养后, 可见淋巴细胞活化、 增殖, 有成团现象。 图 3 NIT 刺激前、 后淋巴细胞增殖的形态学分析（略）A: 刺激前的淋巴细胞; B: 刺激后的淋巴细胞.2.4
10、 融合蛋白 Wee1 GFP 的抗凋亡效应 以效靶比为 12.51 时检测转Wee1 GFP 基因细胞的抗凋亡功能。效应细胞鼠 TcA 和鼠 TcB 分别与靶细胞作用后, 用 ELISA 凋亡检测试剂盒检测波长为 405 nm 的各孔 A 值。根据公式计算实验孔核小体聚集因子（图 4）。聚集因子的值越小, 细胞凋亡形成的核小体数量越少, 即发生凋亡的 NIT 细胞越少。由下图可见转染 Wee GFP 的 NITw g 细胞实验组聚集因子的值明显低于转染空载体的靶细胞组（P0.01）, 因此发生凋亡的细胞数较少。经体内外联合免疫小鼠制备的效应细胞 TcB 诱导细胞凋亡的能力明显强于体外混合细胞培
11、养诱导的效应细胞 TcA（P0.05）。图 4 效应细胞介导的细胞凋亡检测（略）52.5 Wee1 GFP 抵抗效应 T 细胞介导的细胞毒作用 采用 LDH 法检测效应细胞鼠 TcA 和鼠 TcB 对转基因细胞的细胞毒作用。以效靶比 12.51, 测定细胞杀伤率。图 5 显示, 转染 Wee GFP 的 NITw g 细胞的细胞杀伤率明显低于转染空载体的 NITg 细胞（P0.01）, 且经体内外联合免疫小鼠制备的效应细胞 TcB 介导的细胞毒效应强于体外混合细胞培养诱导的效应细胞 TcA（P0.05）。图 5 效应细胞介导的细胞毒效应检测（略）3 讨论1 型糖尿病是一种以 T 细胞介导为主的
12、自身免疫病, 针对该病的发病机制, 可采用多种策略进行干预。自身免疫性糖尿病患者由于自身免疫耐受被打破, 其自身反应性 T 细胞选择性破坏胰岛 细胞而导致糖尿病的发生1。杀伤性 T 细胞可通过释放穿孔素、 颗粒酶引起靶细胞的破坏, 其中颗粒酶是主要的效应分子之一2, 通过多种机制启动细胞凋亡3。颗粒酶进入靶细胞可促使靶细胞 DNA 片段化, 引起细胞凋亡。CDC2 是一个丝氨酸 苏氨酸激酶, 在正常细胞周期中受到严密调控, 当 CDC2 tyr 15 磷酸化时, CDC2 活性被抑制, 细胞停留在分裂间期; 当 CDC2 tyr 15 去磷酸化时则被激活, 细胞进入有丝分裂。在颗粒酶引起靶细胞
13、凋亡的过程中, 颗粒酶可使 cdc2 提前异常激活, 导致“灾难性有丝分裂”（mitotic catastrophes）4, 细胞复制尚未完成即过早进入有丝分裂期, 导致有丝分裂不能正常进行, 最终发生细胞凋亡。Wee1 是调控细胞周期 G2 期阻滞的关键元件5, 在保证细胞进入有丝分裂前完成 DNA 复制以及在 DNA 损伤修复中起着关键作用6。Wee1 通过磷酸化 CDC2 第 15 位上的 Tyr 而抑制 CDC2 的6激活, 因而可控制细胞有丝分裂时间, 并可抑制细胞凋亡。实际上, Wee1 基因编码的蛋白质是一种抑制剂, 可延迟有丝分裂的起始。因此, Wee1 激酶有调控细胞周期和细
14、胞凋亡的双重作用。如果 Wee1 的抑制作用不足以抵抗外界因素导致的CDC2 的激活, 则细胞仍将死亡。在本研究中, 通过基因工程技术增强 Wee1 在靶细胞中的表达, 也就增强了细胞对 CDC2 的抑制, 延缓了细胞进入不正常的有丝分裂, 使细胞有足够的时间进行 DNA 复制和修复, 增强了细胞对损伤因素的抵抗。因此, 转染了 Wee1 GFP 的 NIT 1 细胞对效应细胞介导的细胞毒作用有明显抵抗。当然, 通过 Wee1 基因修饰并不能完全抵抗杀伤性 T 细胞对胰岛细胞的杀伤, 因为杀伤性 T 细胞还可通过穿孔素、 Fas/FasL 等多种途径引起靶细胞的损伤, 如能从多方面保护胰岛细胞
15、, 则可更有效的提高移植胰岛细胞的存活率及延长其存活时间。本研究在体外混合 NIT、 淋巴细胞培养时应加入适量 IL 2 或 ConA 以维持淋巴细胞的生长及增殖。IL 2 可上调淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶 A、 B 的表达, 有资料显示, IL 2 与 T 细胞一起培养, 可诱导颗粒酶 A、 B 的表达升高 2030倍。 因此, 本研究在体外用 NIT 诱导特异性 CD8+T 细胞的增殖及杀伤活性, 同时加入了 IL 2, 获得较高的增殖效应。另外, 本实验给小鼠腹腔反复注射 NIT 可获得特异性较强的 CTL, 其杀伤活性强于体外混合 NIT 淋巴细胞获得的鼠 CTL, 其原因可能是机体内拥
16、有完善的免疫系统, 能有效地将抗原提呈给免疫活性细胞, 并可激活体内特异性及非特异性免疫细胞释放各种细胞因子, 刺激 CTL 活化、 增生、 分化形成效应性 CTL。因此, 小鼠体内免疫刺激获得的 CTL 的特异性杀伤能力强于体外混合 NIT 淋巴细胞获得鼠 CTL。如果经体内免疫诱导的 T 细胞, 在体外进一步用相应抗原诱导, 便可获得高特异性、 高活性的 CTL。7【参考文献】1 赵召霞, 刘 阳, 于春雷, 等. 链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠胸腺中CD4+CD25+调节性 T 细胞的变化J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(3): 324-326.2 Lieberman J. The ABCs of granule mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenalJ. Nat Rev Immunol, 2003, 3(5): 361-370.3 Catalfamo M, Henkart PA. Perforin an
