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1、1COL1a1、COL3a1 在发育性髋脱位患儿圆 韧带的表达作者：王恩波，赵群，李连永，史立伟，李建军，高红【摘要】 目的探求发育性髋脱位(developmental dislocation of the hip,DDH)患儿与正常儿圆韧带中、型胶原在 mRNA 及蛋白水平的表达差异。 方法选取性别相同年龄相近的 6 对发育性髋脱位患者及正常儿配对比较。采用半定量 RT-PCR 及 Western-Blot 法检测 COL1a1、COL3a1 在 mRNA 及蛋白水平的表达。图像分析软件进行量化分析，并经统计学处理。 结果COL1a1 在 DDH 组 mRNA 及蛋白水平表达均较正常对照组降
2、低(P0.01)；COL3a1 在 DDH 组 mRNA 及蛋白水平表达与正常对照组无显著差异(P0.05)。 结论DDH 患儿圆韧带中 I 型胶原在 mRNA 及蛋白水平表达较正常同性同龄儿降低，可能是导致 DDH 患儿髋关节松弛的原因。DDH 患儿髋关节松弛可能与型胶原含量无关。 【关键词】 发育性髋脱位； 圆韧带； 关节松弛； 胶原Abstract: ObjectiveTo investigate the expression of collagen type I and III at mRNA and protein level in the ligamentum teres of d
3、evelopmental dislocation of the hip(DDH) and the normal hip. MethodThere were 6 pairs joint laxity of patients of DDH group and normal control group with paired control of same sex and age.Semiquantity RT-PCR method was used to detect the COLlal and COL3al in the ligamentum teres at mRNA level. West
4、ern-Blot method was used to detect the COLlal and COL3al in the ligamentum teres at protein level. The quantitative analysis of the COLlal and COL3al were performed by professional image software and the results were analyzed with standard statistical methods.ResultAt both mRNA and protein level COL
5、lal expression were decreased in the DDH group compared to the control group(P0.01). There was no significant difference for COL3al between DDH and control group at either mRNA or protein level (P0.05).ConclusionThe decreased collagen I expression at mRNA and protein level in the ligamentum teres of
6、 the children with DDH may lead to hip joint laxity.Hip joint laxity in DDH may be 2independent to the content of collagen III.Key words：developmental dislocation of the hip; joint laxity; ligamentum teres; collagen关节囊与韧带松弛是导致发育性髋脱位(developmental dislocation of the hip,DDH)的主要因素之一。胶原纤维是构成圆韧带中细胞外基质的主
7、要成分，并使其保持一定的强度和韧性。各型胶原结构和(或)含量的变化可能会导致其拉伸增强作用下降，发生关节松弛。目前关于 DDH 圆韧带内胶原蛋白的研究国内外报道较少。本研究应用分子生物学检测技术比较、型胶原在转录水平和蛋白水平的表达差异。试图从分子水平揭示 DDH 患儿髋关节松弛的机理。1 材料和方法1.1 标本来源及制备DDH 组髋圆韧带标本 6 例，均无家族史，不合并其他畸形。来源方式：手术复位中切除的患髋圆韧带。与 DDH 组性别相同年龄相近(6 个月)正常儿童髋关节圆韧带 6 例。来源方式：4 例来源于股骨颈肿瘤手术切除之圆韧带，2 例来源于意外死亡后尸检。取材部位及方法同 DDH 组
8、。以上标本获取均获得监护人书面授权，并获得医院伦理委员会书面认可。剪取原韧带中间 13 部分深低温保存。1.2 半定量 RT-PCR1.2.1 组织总 RNA 提取圆韧带组织总 RNA 提取按照 Invitrogen 公司(美国)提取试剂盒说明书进行。紫3外分光光度计检测 RNA 纯度及浓度，纯度为 1.691.94。1.2.2 逆转录合成 cDNA参照 TAKARA 公司逆转录试剂盒(大连 TAKARA 公司)说明书进行。在 20 l 反应体系中另加入样本 RNA 模板 2 l,2Buffer 10 l； 25 mmol/L MgSO4 4 l；10 mmol/L dNTPs 1 l；22
9、ul AMV 1 l；50 mol/L ligo-dT 1 l；40 uI RNase inhibitor 0.5 l； ddH20 0.5 l。混匀后置于下列温度反应：651 min，30 5 min，于 30 min 匀速升温至 65，6530 min，985min，55min。1.2.3 聚合酶链反应在 25 l 反应体系中，分别加入：DNA；ddH20；PCR buffer(10)；dNTPs(各 2.5 mmol/L)；TaqDNA 聚合酶(5 ul)；待测指标的上游引物和下游引物(上海英俊生物公司)；引物终浓度为 520 pmol/L。各指标及内参 GAPDH 引物的序列、扩增条件
10、见表 1。表 1 PCR 引物序列及产物长度引物名称核苷酸序列产物长度(bp)Genebank 循环条件 COLlal上游 5-AACATAATCCGCAGTGGCCT-3下游 5-CTCCTGTTGCGTTGCTCCTT-3509BC03653194 3 min， 94 30 s65 40 s，72 1 min35 个循环后，72 7 minCOL3al上游 5-CCCAGAACATCACATATCAC-3下游 5-CAAGAGGAACACATATGGAG-3366NM00009094 3 min， 90 30s58 40 s， 72 1 min435 个循环后，72 7 minGAPDH上
11、游 5-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3下游 5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3307XR01831795 3 min， 95 30 s6030 s，721 min40 个循环后，72 7 min1.2.4 PCR 产物电泳及检测取反应产物 10 l 在含有溴化乙锭的 2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下检查特异条带，1Dkodar 成像系统成像，应用 Scion image 软件对条带灰度进行半定量分析。1.3 Western-blot1.3.1 胶原标本制备标本称重，在酸性条件下(0.5 mol/L 乙酸,pH2.5)以 10%胃蛋白酶消化 22 h。-419 000 r
12、/min 离心 1 h，2 mol/L NaCl 加入上清，-419 000 r/min 离心 1 h，上清即为可溶胶原。1.3.2 蛋白定量按酚试剂法测定并调平蛋白质浓度。1.3.3 变性加入 2%-巯基乙醇 100变性 1 min。1.3.4 电泳5取 20 l 蛋白上样，经 7.5%聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 2 h，电压 130 v。1.3.5 转膜将 PAGE 凝胶中的蛋白通过电转移槽转移至硝酸纤维素膜上，2 h，电压 40 v。1.3.6 封闭TBS 洗膜 1 次，加入含 8%BSA 的 TTBS 4过夜。1.3.7 一抗孵育TBS 洗膜 3 次，每次 5 min，分别
13、加入山羊抗人、兔抗人多克隆抗体(11 000)(Santa 公司，美国)，室温下 2 h。1.3.8 二抗孵育加入碱性磷酸酶标记的二抗(1200)(北京中山生物公司)，室温 4 h。1.3.9 显色以碱性磷酸酶染色液染色。1.3.10 结果分析用自动电泳凝胶成像系统采集图像，应用 Scion Image 软件对免疫印迹条带进行半定量分析。1.4 统计学处理采用 SPSS 软件(10.0 版本，美国)进行统计学分析，P0.05 视为统计学上显著6差异。配对比较采用配对 t 检验。 2 结果2.1 RT-PCRDDH 组小儿圆韧带 COL1a1 mRNA 的表达较对照组降低(P0.01)；COL3
14、a1 mRNA 表达与对照组无显著差异(P0.05)。见图 1 及表 2。2.2 Western-blotDDH 组小儿圆韧带 COL1a1 的蛋白表达较对照组降低(P0.01)，COL3a1 的蛋白表达与对照组无显著差异(P0.05)，见图 2 及表 3。表 2 6 对 DDH 组与对照组小儿圆韧带 COL1a1、COL3a1 mRNA 的表达编号性别 DDH 组对照组年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH*年龄（岁）COL1a1/GAPDH*COL3a1/GAPDH*1 男 3.10.410.592.61.070.822 女 3.30.440.662.80.720.6
15、33 女 4.90.580.665.00.890.684 男 5.00.290.865.00.770.825 女6.70.430.757.11.040.716 女 9.20.410.738.80.980.75 配对 T 检验：*P=0.001；*P=0.556 表 3 6 对 DDH 组与对照组小儿圆韧带 COL1a1 和 COL3a1的蛋白表达差异编号性别 DDH 组对照组年龄3 讨论以往的研究发现髋脱位患儿多伴有关节松弛，这与髋脱位术中所见松弛薄弱的关节囊与圆韧带相符。因此髋关节松弛是导致髋脱位主要因素之一也得到了普便认同1。但作为杵臼关节的髋关节要保持稳定，主要依靠骨的形态，而关节囊及圆
16、韧带则能保持它们固定于正常的位置。人类出生时髋臼较浅，股骨头表面为平滑弧线，出生后髋臼不断加深，股骨头弧度加大，髋关节逐渐稳定，而这需要头臼同心的相互作用才能达到。而关节囊和圆韧带则具有保持这种头臼同心位置的重要作用。7构成圆韧带并发挥抗生物张力生理功能的主要成分是胶原纤维。胶原是人体中最为丰富，分布最为广泛的一组糖蛋白分子，约占人体蛋白总量的 30%。胶原分子是由三条多肽链形成的一种特殊的右手三螺旋结构，并根据其结构特点分为两大类2：即经典的纤维形成胶原和非纤维形成胶原。、型是最为经典纤维形成胶原。这三种胶原约占体内总胶原的 80%90%，因此也成为研究的重点。胶原分子主要由成纤维细胞、成骨细胞等合成、分泌。具有三螺旋结构的胶原分子被转运至细胞外通过共价键相互交联形成胶原纤维3。圆韧带主要由、型胶原参与构建，型胶原分子式为1()3 或1()
