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1、1胚胎小鼠肾脏发育中神经型一氧化氮合 酶的定量分析作者：穆长征 王小梅 陶仕英 刘霞 包翠芬【摘要】 目的：探讨神经型一氧化氮合酶在胚胎小鼠妊娠不同时期肾脏发育中的意义。方法：选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例 3：1 同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。选取胚龄 12 天(ED12)、14 天(ED14)、16 天(ED16)、18 天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0)仔鼠，分 5 组，每组各 6 只母鼠，每只母鼠取 2只胎鼠或仔鼠，剖腹取肾脏，用免疫印迹技术（Western blot ）及光密度分析系统分别对各组胎鼠或仔鼠肾脏内 nNOS 进行定量检测。结果 ： West
2、ern blot 及光密度分析显示， ED14 组肾脏 nNOS 含量最少，随后逐渐增多，PD0 组肾脏 nNOS 含量最多。结论：胚胎小鼠肾脏 nNOS 在胚胎第 14 天开始呈阳性表达，以后含量逐渐升高，出生时含量最高，表明 nNOS 在胚胎小鼠肾脏发育的早期阶段起重要作用。 【关键词】 神经型一氧化氮合酶； 胚胎小鼠； 肾脏一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase， NOS）是一氧化氮（NO）合成的限速酶，是调节 NO 的重要环节。NO 通过 NOS 产生，是一种可作为信使分子的自由基气体1，可激活可溶性鸟苷酸环化酶，通过生成 cGMP 而发挥作用。NOS 可分为内皮型（
3、endothelial NOS，eNOS）、神经型（neuronal NOS, nNOS）和诱导型（inducible NOS，iNOS）3 类。NO 在肾脏血流动力学和肾脏多种生理功能中的作用决定 NOS的活性改变，NO 可通过调节肾小球毛细血管压和管球反馈来调节肾血流量，是2有效调节肾脏的血液动力学的舒张因子，能对抗缩血管物质，参与调节血管张力。尽管国内外学者对成年肾脏 NOS 的表达进行大量的研究，但 nNOS 在胚胎肾发育过程中动态表达尚未见报道。本实验通过观察妊娠不同时期胚胎小鼠肾脏nNOS 的表达，旨在探讨 nNOS 在胚胎小鼠肾脏早期发育中的意义。1 材料和方法1.1 实验动物昆
4、明小白鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供。1.2 主要试剂丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、甘氨酸购于北京中杉金桥生物技术有限公司；Tween-20、Tris、SDS 和硝酸纤维素膜购于华美公司。1.3 动物培养与分组选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例 3：1 同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为 0 天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早 8 时、晚 5 时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为出生时。选取胚龄 12 天(ED12)、14 天(ED14)、16 天(ED16)、18 天(ED18)的胎鼠及出生时(PD0) 仔鼠，分
5、5 组，每组各 6 只母鼠，每只母鼠取 2 只胎鼠或仔鼠。1.4 Western blot 测定肾脏 nNOS 含量各组胎鼠或仔鼠脊椎离断后剖腹取左肾，PBS 冲洗，滤纸吸干，将完整左肾入液3氮迅速冷冻，-70冰箱保存待用。取冷冻待用的左肾组织，加入 3 倍体积的细胞裂解液，0下剪碎、匀浆，将组织匀浆液静止 30min，冷冻离心机（10000r/min）离心 10min，取 15l 上清液，用 Bradford 法测定蛋白含量后，分装成每离心管中含10g 蛋白，-20保存备用。配置 8%SDS 聚丙烯酰胺分离胶和 5%的浓缩胶，取 10g 肾组织蛋白细胞裂解上清液，加入 10l SDS 样品缓
6、冲液，100加热 3 min，离心。然后取上述裂解液，加到电泳胶的样品孔，100V 电压下电泳，待指示剂达到分离胶时，将电压增至200V，直到指示剂达到胶的底部。将胶板取下，在转移缓冲液中洗涤 10min，将胶与 0.45m 硝酸纤维素膜置于滤纸与海绵之间，赶尽气泡，常温下，半干转印。至转印好的硝酸纤维素膜，TBS（Tris 盐缓冲液）冲洗 2 遍，5%脱脂奶粉溶液室温封闭 4过夜，分别与一抗（兔抗鼠 nNOS 多克隆抗体）（稀释度为 1：400），4孵育过夜，TBST（TBS-0.5%Tween-20 溶液)洗脱 3 次,再与二抗-HRP 标迹的羊抗兔IgG 抗体（稀释度为 1：200）室温
7、孵育 1h,以 TBST 溶液洗脱 3 次后与 DAB 试剂显色,扫描电泳条带，用 Band Leader 软件分析电泳条带光密度。1.5 统计学分析应用 SPSS11.5 统计软件包进行统计分析，所有数据均以均数标准差（xs）形式表示，采用双因素方差分析和 q 检验。以 P0.05 为差异有显著性意义。 2 结果以测得的 nNOS 最大值为 1,计算各组 nNOS 表达相对含量(百分数)。PD0 组含量最高（100%）， ED14 组 nNOS 含量最低（46.62.8%，两者比较 P0.01)，ED16 组含量升高（为 57.33.6 %，与 ED14 组比较 P0.05），ED18 组含
8、量进一步升高（为477.53.2 %,与 ED16 组比较 P0.01, 与 PD0 组比较 P0.01）。胚胎小鼠不同发育阶段 nNOS 含量分析用 Western blot 电泳条带和光密度百分数表示。 见表 1、图 1、图 2。表 1 小鼠不同发育阶段肾脏 nNOS 表达的光密度（%）（略）注：*与ED14 组比较 P0.05；与 ED14 组比较 P0.01，#与 ED16 组比较 P0.01；与 ED18 组比较 P0.01。3 讨论NO 对肾血流量和局部微循环具有重要的调节作用2。Solhaug3证实，NO 是唯一在新生动物中具有血管舒张功能的因子。他认为与成年肾脏相比，由于新生肾
9、脏含有大量高活性血管收缩因子，其中包括肾素、血管紧张素系统，这些因素导致新生肾脏血管阻力（RVR）高，RBF 和 GFR 低，且处于低氧环境使肾脏血管阻力（RVR）进一步增高4,5，为了维持胚胎小鼠肾脏早期发育阶段的肾血流量，保护肾免受损伤，NO 作为有效的调节肾脏血液动力学的舒张因子，能对抗缩血管物质，参与调节血管张力，维持基本肾血流量和增加肾小球滤过率6。在肾脏早期发育过程中，NO 主要通过舒血管效应调节肾 RBF 与 GFR，在调节胚胎肾脏功能方面起着重要作用。本实验的免疫印迹结果发现，胚胎小鼠不同发育阶段中，出生时的肾脏 nNOS 含量最高。nNOS 是一种结构酶，其表达越多，产生 N
10、O 越多，作为胚胎小鼠体内唯一的血管舒张功能因子，通过对抗高活性血管收缩因子特别是血管紧张素的作用，增加肾 RBF 及 GFR，调节肾脏正常的生理活动。一般认为胚胎动物的 RBF 最小，肾脏 nNOS 含量最高，以后逐渐降低，这是由于随着肾功能的自我完善、RBF的增加造成的。因此胚胎小鼠的高 RVR、低 RBF、低 GFR 的生理特点是促使nNOS 表达的主要因素。此外 nNOS 的表达还与细胞自身的生长发育与增殖、母5体的环境以及肾脏自身血液动力学相关。出生时动物具有高的雌激素和雌激素的受体，不同实验发现雌激素能通过增加基因的转录水平上调 nNOS mRNA 表达，因而在胚胎小鼠 nNOS
11、的表达可能受母体的雌激素影响7,8。另外生长因子也能上调 nNOS 的表达，转录生长因子-1（TGF-1）在肾发育中高度表达，在细胞的培养中，它可以直接刺激 nNOS 的表达9。更有一些学者认为10，低氧参与nNOS 的合成与调节，胚胎动物一般处于缺氧状态，它能上调 nNOS 的表达。综上所述，我们认为胚胎小鼠 RBF 变化与 nNOS 有密切关系。由此推断在肾脏功能发育的早期，nNOS 对肾脏血液动力学的调节起着重要作用。【参考文献】1 Node K，Kitakaze M，Kosaka H，et al. Plasma nitric oxide end products are increas
12、ed in the ischemic canine heart. Biochem Biophys Res Commun, 1995,211:370374.2 马慧娟,刘宜先,何瑞荣. 一氧化氮肾内作用研究进展.河北医科大学学报,2003,24(5):307310.3 Solhaug MJ, Dong X , Adelman RD, Dong KW. Ontogeny of neuronal nitric oxide synthase, NOS 1, in the developing procine kidney. Am J Physiol Regulatory Integrative Com
13、p Physiol, 2000,278:14531459.4 齐学成,左藤.大鼠血管生后发育的扫描电镜研究.沈阳医学院学报，1997，11（3）：9 .5 Guignard JP, Gouyon JB, John EG. Vasoactive factors in the immature kidney. Pediatr Nephrol Jul, 2003,5(4):443446.6 吕宇涛,等.正常小儿肾脏血流阻力的研究.中华小儿外科杂志，2003，24（3）：239242.7 Welch WJ, Wilcox CS. What is brain nitric oxide synthase
14、doing in the kidney Curr Opin Nephrol Hypertens, 2002,11(1):109115.68 Ang, X, Barber DA, Lewis DA, et al. Gender and transcriptional regulation of NO synthase and ET-1 in porcine aortic endothelial cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2000,273:19621967.9 Basile, DP, and Hammerman MR. TGF-beta in renal development and renal growth. Miner Electrolyte Metab,2001,24:144148.10 Morikawa I, Togari H, Hyodo J, et al. Nitric oxide modulates premature renal circulation in hypoxic newborn piglots. Biol Neonate, 1998,74(1):2230.
