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1、1一种复配型玛咖保健品对小鼠免疫功能 的影响作者：金文闻，张永忠，敖明章，余龙江【摘要】 目的 探讨一种添加了西洋参总皂苷的玛咖保健品对小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞吞噬功能以及 NK 细胞活性的影响。方法 实验组小鼠每日分别灌胃高、中、低剂量的复配玛咖根干粉，连续 30 天，然后分别进行 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、小鼠半数溶血值（HC50）测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验和 NK 细胞活性测定。结果 与对照组比较，各剂量组均能提高 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化能力、小鼠巨噬细胞吞噬能力和小鼠 NK 细胞活性(P0.05 或 P0.01)，在中、高剂量组能提高小鼠
2、的半数溶血值（P0.01)。结论 复配玛咖根干粉对小鼠各项免疫功能指标均有显著提高作用，可见该复配型玛咖保健品具有增强免疫力的功效。【关键词】 玛咖；免疫功能；保健品【Abstract】 Objective To evaluate the effects of a Maca healthy product compounded with ginsenosides on cell-mediated immune function，humoral immune function，macrophage phago-function and NKC activity of mice.Methods M
3、ice in the treatment group were perfused by the test compound in three different dose (high： 1.000 g/kg BW；medium：0.200 g/kg BW；low：0.020 g/kg BW) continuously for 30 days，then the research on the experiments on immune regulation，including ConA- induced lymphocyte transformation test total hemolytic
4、 complement assay (HC50 assay)，peritoneal macrophage phago-function mensuration and NKC activity assay were taken.Results In comparison with control group，the lymphocyte transformation rate，the ability of phagocytosis and the NKC activity significantly increased in the treatment group in all dose (P
5、0.05 or P0.01)， and the HC50 value significantly increased in high and medium dose (P0.01).Conclusion Powdered Maca root compounded with ginsenosides could significantly improve the immune function of 2mice，and the compounded Maca healthy product possessed the effects in enhancing the immunity.【Key
6、words】 Maca (Lepidium meyenii.)；immune function；healthy product玛咖（Maca， Lepidium meyenii.Walp）为十字花科独行菜属的一年生或两年生草本植物，原产于秘鲁海拔 3500 米以上的安第斯山区。数千年来玛咖根作为食物、草药被广泛用于增强精力，抗疲劳，提高生育力，治疗女性更年期综合征，抗抑郁和抗贫血等13，近十年更在国际上被开发成多种保健食品，受到全球保健人士的青睐4。我国也在 3 年前引入了玛咖保健品，但目前产品功能单一，与国际上产品在功效上有比较大差距。国际上已经流行将玛咖根粉进行浓缩或者进行复配，这不仅提高
7、了玛咖保健品的功效，更赋予“Maca”这一国际知名品牌产品更多的适用范围，例如将玛咖与鹿茸、银杏提取物等天然产品复配后得到的产品，均得到国际消费者的喜爱。玛咖具有显著的增强精力和抗疲劳作用5，而它虽然具有“适应原”样作用，但免疫调节作用并不显著4。鉴于抗疲劳和免疫调节具有密切联系6，添加合适比例的具有增强免疫力作用的天然植物提取物将可能使玛咖保健品具有抗疲劳和增强免疫力双重作用。我们将药食两用植物西洋参（Panax quinquefolium L.）的功效成分西洋参总皂苷按照合适的比例添加到玛咖根干粉中，以此为原料制备成一种复配型玛咖保健食品。本文就是通过实验对该产品在小鼠细胞免疫功能、体液免
8、疫功能、巨噬细胞吞噬功能以及 NK 细胞活性等方面的影响进行考察，从而评价其在增强免疫力方面的功效。1 材料与方法31.1 材料 玛咖根干粉是由秘鲁利马 AGRO NATURALES S.R.L.于 2004 年 9 月提供；西洋参总皂苷粉是由中国广东省深圳思味特科技有限公司于 2004 年 10 月提供，含西洋参总皂苷80%。玛咖根干粉和西洋参总皂苷粉按照重量比 93：7 进行均匀混合，制备成复配型玛咖根干粉。常温保存，供实验用。1.2 实验动物及受试方式 实验动物选用 BALB/C 清洁级雌性小鼠 120 只，体重1822g，均由湖北省实验动物中心提供。将小鼠随机均分为 8 组，其中 4
9、组为免疫组，进行 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK 细胞活性测定；另 4 组为免疫组，进行小鼠半数溶血值（HC50）测定、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。参考国内外玛咖根干粉和西洋参总皂苷的食用量，初步设计本次实验的剂量为每日 0.200 g/kg BW，上下再各设 1 个剂量组 1.000g/kg BW 和 0.020g/kg BW。因此免疫组和组各自的 4 组小鼠分别对应高、中、低 3 个剂量组和对照组。样品用蒸馏水配置，对照组以蒸馏水代替受试物。每日灌胃 1 次，每次 20ml/kg BW，连续 30 天后测定各项指标。1.3 实验方法1.3.1 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞
10、转化实验7 小鼠颈椎脱臼处死后，无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks 液的小平皿中，制成细胞悬液。用 Hanks 液洗 3 次，每次 1000rpm 离心（德国 CHRiST 冷冻离心机）10min。然后将细胞悬浮于 2ml 的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为 2106 个/ml。将细胞悬液分 2 孔加入 24 孔培养板中，每孔 1ml，在其中 1 孔加 50l ConA 液（相当于 5g/ml），另 1孔作为对照，置 5% CF-autoflow 型 CO2 细胞培养箱（美国 NuAir Inc.）中，37培4养 72h。培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清液 0.7ml，加入 0
11、.7ml 不含小牛血清的RPMI 1640 培养液，同时加入 MTT（5 mg/ml）50l/孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1ml 酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到酶标微孔板中，每孔做 3 个平行孔，用960 型全自动酶标仪（美国 Metertech Inc.），以570nm 波长测定光密度值。淋巴细胞的增值能力用加 ConA 孔的光密度值减去不加 ConA 孔的光密度值表示。1.3.2 半数溶血值（HC50）的测定8，9 取羊血，生理盐水洗涤 3 次，每只鼠经腹腔注射 2%（v/v，用生理盐水配制）压积 SRBC 0.2ml 进行免疫。5 天后，小鼠摘眼球取血
12、于离心管内，放置约 1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心 10min，收集血清。用 SA 缓冲液将血清稀释为 400 倍，取 1ml 置试管内，依次加入 10%（v/v，用 SA 缓冲液配制）压积 SRBC 0.5ml，补体 1ml（用 SA 缓冲液按 1：10 稀释）。另设不加血清的对照管（以 SA 缓冲液代替）。置 37 恒温水浴中保温 30min 后，冰浴终止反应。2000rpm 离心 10min，取上清 1ml，加都氏试剂3ml。同时取 10%（v/v，用 SA 缓冲液配制）压积 SRBC 0.25ml，加都氏试剂至 4ml于另一试管中，充分混匀，放置 10mi
13、n 后，于 540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下式计算：HC50=样品光密度值SRBC 半数溶血时的光密度值稀释倍数(400)1.3.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验8，9 小鼠颈椎脱臼处死后，腹腔注射加小牛血清的 Hanks 液 4ml/只，轻轻按揉腹部 20 次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开 1 个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液 2ml 于试管内。用 1ml加样器吸取腹腔洗液 0.5ml 加入盛有 0.5ml 1%鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。5用注射器（装大针头）吸取 0.5ml 混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱
14、内 37孵育 15min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa 液染色 15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用 40 倍显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率%=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数计数的巨噬细胞数100吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数计数的巨噬细胞数1.3.4 NK 细胞活性的测定8，9 实验前 24h 将靶细胞 YAC-1 进行传代培养，应用前以 Hanks 液洗 3 次，用含 10%小牛血清的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 4105 个/ml。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hanks 液洗 3 次，1500rpm
15、 离心 10min，在用 2ml 含 10%小牛血清的 RPMI 1640完全培养液重悬，用台酚兰染色计数（活细胞数应在 95%以上），调整细胞浓度为2107 个/ml，使效靶比为 50：1。取靶细胞和效应细胞各 100l，加入 U 形 96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100l，靶细胞最大释放孔加靶细胞和 2.5% Triton 各 100l；上述各项均设 3 个平行孔，37，5%CO2 培养箱中培养 4h，将 96 孔板以 1500rpm 离心 5min，每孔吸取上清 100l 置酶标板中，加入LDH 基质液 100l，反应 10min，然后每孔加入 1mol 的 HC
16、l 溶液 30l 终止反应，在酶标仪 490nm 处测 OD 值，NK 细胞活性按下式计算：6NK%=反应孔 OD-自然释放孔 OD最大释放孔 OD-自然释放孔 OD1001.4 实验数据统计 采用 Origin 统计软件对实验结果进行单因素方差分析和多个实验组与 1 个对照组间均数的两两比较方法进行统计学处理，实验数据结果采用xs 表示，差异显著性通过 P 值判定。 2 结果2.1 受试物对小鼠细胞免疫功能的影响 见表 1。表 1 复配型玛咖根干粉对 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化能力的影响 （xs，n=15）剂量组注：与对照组相比，*P0.01经口给予小鼠不同剂量的复配型玛咖根干粉 30 天，进行 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化能力检测，通过表 1 的实验结果和统计数据可以发现，各剂量组与对照组比较，差异均有非常显著性（P0.01）。即复配型玛咖根干粉在各剂量组均能提高 ConA 诱导的小鼠淋巴细胞转化能力。2.2 受试物
