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1、1HPLC 法测定羧甲司坦无糖口服溶液中羧 甲司坦的含量及有关物质【摘要】 目的 建立羧甲司坦的含量测定及有关物质检测的方法。方法 采用 HPLC法，以 C18 柱（4.6 mm150 mm，5 m）为色谱柱，以 0.68%磷酸二氢钾和 0.05%己烷磺酸钠（pH2.5）为流动相，检测波长为 215 nm。结果 羧甲司坦在 0.441.3 mgmL-1 范围内，峰面积与质量浓度呈良好的线性关系（r=0. 999 9），平均回收率为 99. 5%，RSD 为 1.1%（n=9），最低检测限为 8.27 ng，各杂质峰与主峰达到基线分离。结论 本法简便、专属性及重现性好，可用于羧甲司坦含量及有关物
2、质的测定。 【关键词】 羧甲司坦 反相高效液相色谱法 有关物质羧甲司坦为半胱氨酸的巯基取代衍生物，2005 年版中国药典收裁了该品种（含糖型），采用茚三酮显色比色法测定其含量1，也有文献报道采用 HPLC 蒸发光散射检测法2和柱前衍生荧光检测法3与反离子对色谱法4测定其含量和有关物质。本文采用反相离子对液相色谱法测定羧甲司坦的含量和有关物质，试验结果表明，该方法简便、专属性强、准确度高和重现性好。1 仪器与试药 美国 Agilent1100 高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（DAD），ChemStation System 工作站。羧甲司坦对照品（中国药品生物制品检定所），羧甲司坦口服溶液（无糖
3、型，批号：051101、051102、051103， 规格：0.2 g/10 mL，由广州白云山制药总厂提供），2己烷磺酸钠（分析纯，由 Pure Chemical Analysis Co.,Ltd.提供），其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 含量测定2.1.1 溶液的制备 对照品溶液的制备: 精密称取羧甲司坦对照品 50 mg，置50 mL 量瓶中，加 0.1 molL-1NaOH 溶液 5 mL，使溶解，并加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。供试品溶液的制备：精密量取本品适量，加水稀释制成每 1 mL 中约含羧甲司坦 1 mg 的溶液。空白辅料溶液的制备：取辅料适量，按照处方配比，
4、制成不含主药羧甲司坦的空白溶液。2.1.2 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm150 mm，5 m）；流动相：0. 68%磷酸二氢钾和 0.05%己烷磺酸钠，用磷酸调 pH 值 2.5；检测波长：215 nm；进样量：10 L。理论塔板数按羧甲司坦计算为 5 000，羧甲司坦峰与相邻峰的分离度符合规定，阴性对照无干扰。色谱图见图 1。A.羧甲司坦对照品;B.羧甲司坦无糖口服溶液供试品;C.阴性对照品 1羧甲司坦 图 1 羧甲司坦无糖口服溶液的 HPLC 谱图（略）Figure 1 HPLC of chromatogram32.1.3 线性试验 精密称取羧
5、甲司坦对照品适量，置 100 mL 容量瓶中，加 0.1 molL-1NaOH 溶液 5 mL，使溶解，加水稀释制成每 1 mL 中约含羧甲司坦 2.2 mg的贮备液，分别精密量取适量，配制成系列浓度，按上述色谱条件测定，以羧甲司坦的质量浓度（）对其相应的峰面积（A）作回归方程，结果在 0. 441.3 mgmL-1浓度范围呈良好的线性关系：A=1966.1+16.771,r=0.999 9（n=6）。2.1.4 精密度试验 取同一份对照品溶液，连续进样 6 次，结果峰面积和保留时间的 RSD 分别为 0. 14%和 0.45%,表明试验精密度良好。2.1.5 重复性试验 精密量取羧甲司坦口服
6、溶液适量，平行 6 份，分别测定含量，结果其 RSD 为 0. 60%。2.1.6 稳定性试验 制备供试品溶液，分别在 0、2、4、6 h 进样，6 h 内测定结果的 RSD 为 0.35%。2.1.7 空白加样回收率试验 按处方比例制备空白对照液，分别加入 3 种比例的羧甲司坦对照液，按“2.1.2”项色谱条件进样测定回收率，结果平均回收率为99.5，RSD 为 1.1%，见表 1。2.1.8 样品的测定 取供试品（批号 051101、051102、051103）按“2.1.1”项方法制备供试液，并按“2.1.2”项色谱条件进样测定，3 批供试品的平均含量分别为101.1%、101.9%、1
7、01.4%。2.2 有关物质测定2.2.1 测定法 量取本品适量，加水稀释制成每 1 mL 中含羧甲司坦 2 mg 的溶4液作为供试品溶液；精密量取 1 mL，置 100 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；按“2.1.2”项下的色谱条件，取对照溶液 10 L，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的 30%；精密量取供试品溶液与对照溶液各 10 L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的 3 倍。表 1 羧甲司坦加样回收率试验结果（略）Table 1 Results of recovery test2.2.2 专属性 对照品溶液：精密称取羧甲
8、司坦对照品 50 mg，置 50 mL 量瓶中，加 0.1 molL-1NaOH 溶液 5 mL，使溶解，并加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。 羧甲司坦+半胱氨酸溶液：用对照品溶液制成每 1 mL 含半胱氨酸 0.5 mg 的混合溶液。酸水解产物：量取本品 2 mL,置 50 mL 量瓶中,加 0.1 molL-1HCl 溶液 10 mL,加水稀释至刻度,摇匀。 碱水解产物：量取本品 2 mL,置 50 mL 量瓶中,加 0.1 molL-1NaOH 溶液 10 mL,加水稀释至刻度,摇匀。热分解产物：取本品 1 支，置沸水中加热 10 min，冷却，量取 2 mL,置 50 mL 量瓶中
9、，加水稀释至刻度,摇匀。强光破坏产物：取本品，在(4500500)Lx 下光照 2 d 后，量取本品 2 mL,置 50 mL 量瓶中, 加水稀释至刻度,摇匀。5氧化降解产物：量取本品 2 mL,置 50 mL 量瓶中,加过氧化氢 0.1 mL，加水稀释至刻度,摇匀。阴性对照液：取口服溶液的空白辅料适量，用水制成每 1 mL 含羧甲司坦 1 mg的辅料溶液。取上述溶液分别进样检测。色谱图见图 2，有关物质测定结果见表 2。表 2 有关物质测定结果（略）Table 2 Results of the related substances determination图 2 降解产物的色谱图（略）Fi
10、gure 2 HPLC chromatogram of degradation products2.2.3 最低检测限 羧甲司坦的最低检测限为 8. 27 ng。2.2.4 不同 pH 值对产品稳定性的影响 用磷酸盐缓冲溶液配制 pH 值分别为5.5、5.9、6.5、7.0、7. 9、8.1 的供试品溶液，按上述方法测定，结果见表 3。表 3 不同 pH 值的试验结果（略）Table 3 Results of stability at various pH values3 讨论3.1 羧甲司坦为强酸性化合物，分离强酸性化合物常用的离子对试剂是烷剂磺酸盐，经试验：流动相中以 0.05%己烷磺酸钠
11、为离子对时，保留时间约为 5 min，杂质可达到基线分离，因此选择己烷磺酸钠作为离子对试剂。63.2 从羧甲司坦对照品的二极管阵列检测器紫外扫描图看出，羧甲司坦有紫外末端吸收，因此检测波长选择 215 nm。3.3 有关物质专属性研究的图谱提示：（1）半胱氨酸是羧甲司坦合成的前体，羧甲司坦口服溶液在酸、碱、热、强光、氧化条件下被破坏产生的杂质并不是水解产物半胱氨酸；（2）本品在强酸、强碱性、热、强光、氧化破坏条件下，羧甲司坦口服溶液均产生保留时间为 11.5 min 的主杂质峰，推测可能为羧甲司坦的双分子聚合物，有待进一步证实。3.4 pH 值对供试品稳定性的影响试验结果表明：室温时，pH 值
12、对供试品溶液的含量和有关物质的影响不大；供试液经 100 加热 15 min 后，当 pH 值7.4 时，有关物质明显增加，故羧甲司坦口服溶液生产制备时不宜采用高温消毒。3.5 中国药典收载的羧甲司坦口服溶液（含糖型），有 pH 值降低现象，而无糖型产品经 18 个月的稳定性考察，溶液的 pH 值较稳定。3.6 经方法学验证，本法简便、准确,灵敏度高，重复性好，可用于羧甲司坦无糖口服溶液的含量测定和有关物质检查。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典 2005 年版：一部S.北京:化学工业出版社,2005:817.2 陈秀琳,郑小力.HPLC ELSD 法测定羧甲司坦颗粒中羧甲司坦的含量J.中国药品标准,2006,7（3）:62-64.73 毕惠嫦，钟国平，汤铮，等.高效液相色谱法测定人血浆中羧甲司坦浓度J.中国医院药学杂志,2005,25(9):828-830.4 赵雪梅,黄秀明.反相离子对色谱法测定羧甲司坦片和口服溶液中羧甲司坦的含量J.中国药品标准,2007,8（2）:60-63.
