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1、“靶位定向攻击靶位定向攻击”治疗肌无力症的新思路治疗肌无力症的新思路【摘要】：乙酰胆碱受体(Acetylcholinereceptor,AChR)是一种配体介导的离子通道蛋白,由 2,() 共 5 个亚基组成。其中成熟的 亚基是自身免疫病重症肌无力(MyastheniaGravis,MG)的主要免疫原,重症肌无力患者由于自身免疫系统的紊乱,体内产生了非正常的乙酰胆碱受体抗体,该抗体可与乙酰胆碱受体的 67-76,125-147,183-200氨基酸残基结合,减少功能性乙酰胆碱受体数量,抑制乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合,阻碍骨骼肌间神经传导。因此,长期以来,科学家们一直以 AChR-亚基 N-端主
2、要功能区片段为研究对象,从不同角度探讨MG 的发病机理及其治疗的可能手段。本论文在前期工作的基础,着重进行了以下几个方面的研究。AChR_(205)读框被克隆到含不同启动子的表达载体中(如 pUC118,pET32M,pMAL-c2 等)中,并在E.coliBL21 中进行表达,其中目的蛋白只有在重组菌E.coliBL21/pMAL-AChR_(205)中获得了可溶性表达产物 MBP-AChR_(205),表达量可达到细胞总蛋白的 30%,这也是国内外第一次获得 AChR 亚基主要功能区的可溶性表达。经 Amylose 亲和纯化获得了融合蛋白 MBP-AChR_(205),而且经 Factor
3、Xa 拆除可获得单一的 AChR_(205)。同时,偶联在 Amylose 的 MBP-AChR_(205)可作为一种免疫吸附剂。对小鼠抗 AChR 血清的免疫吸附实验表明,大约 75%-98%的 AChRAb 可以被特异性清除,而血清蛋白、IgG、IgM、IgA 仍能维持在正常水平。2 例 MG 病人血清经该免疫吸附剂吸附后,AChRAb 的清除率可达 90%以上,清除效率要比那些化学合成的免疫吸附剂高的多。ELISA 验证在免疫吸附过程中,没有MBP-AChR_(205)或 AChR_(205)的脱落。同时,我们也将目的基因片段延伸到 AChR_(211),并克隆到酵母表达载体pVT、pG
4、APZA、pPIC9K 中,转入酿酒酵母和毕赤酵母中进行分泌型表达。实验结果表明,重组菌 P.pastorisGS115/pPIC9K-AChR_(211)可以分泌表达有功能活性的目的蛋白,表达量可达到 25mg/L。经阴离子交换层析和凝胶过滤层析,可获得电泳纯目的蛋白,并制备成免疫吸附剂,对两例肌无力患者血清中的 AChRAb 清除率可分别达到 84%和 94%。 【关键词】：乙酰胆碱受体 亚基重症肌无力重组免疫吸附剂内蛋白子介导的蛋白质连接基因免疫【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2005【分类号】：R746.1【目录】：第一章乙酰胆碱受体与重症肌无力(综述)1
5、5-321 前言152 乙酰胆碱受体结构与功能 15-202.1 乙酰胆碱受体的结构 15-172.2 乙酰胆碱受体的作用机理 172.3 乙酰胆碱受体结构与功能的关系 17-203 重症肌无力发病机理及治疗方法 20-243.1 重症肌无力形成机理 20-223.2 重症肌无力的细胞免疫机理 223.3 重症肌无力的治疗方法 22-244 重症肌无力治疗的新战略免疫毒素 24-294.1 核糖体失活蛋白 24-274.2 免疫毒素 27-295 参考文献 29-32 第二章乙酰胆碱受体主要功能区的延伸与分子亚克隆 32-401 前言 322 材料 32-342.1 主要仪器设备 32-332
6、.2 主要试剂 332.3 主要试剂配制 33-342.4 菌种和质粒 343 方法 34-363.1 寡核甘酸片段的双链形成 34-353.2 重组质粒pUC-AChR_(205)的分子克隆 353.3 重组质粒的鉴定 353.4 工程菌的诱导与表达 35-364 结果 36-384.1DNA 片段双链的合成 364.2 重组质粒 pUC-AChR_(205)的鉴定 36-374.3 目的基因的序列分析 374.4 重组质粒在 E.coliDH5 中的初步表达 37-385 讨论 38-396 参考文献 39-40 第三章乙酰胆碱受体 亚基主要功能区在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及免疫活性
7、40-611 前言 402 材料 40-422.1 主要仪器设备402.2 主要试剂及配制 40-422.3 菌种与质粒 423 方法 42-483.1AChR_(205)基因片段的克隆及重组子的构建 42-443.2 目的蛋白在不同重组菌的表达 44-453.3MBP-AChR_(205)融合蛋白的表达和纯化 45-473.4MBP-AChR_(205)和 AChR_(205)蛋白的免疫学性质 47-483.5 免疫吸附剂的制备及其吸附性能 484 结果 48-594.1 重组子的双酶切鉴定 48-504.2AChR_(205)在不同表达载体中的表达 50-514.3 融合蛋白 MBP-AC
8、hR_(205)的纯化 51-534.4 融合蛋白 MBP-AChR_(205)的 FactorXa 酶切 53-554.5 融合蛋白 MBP-AChR_(205)与 FactorXa 酶切产物的 Westernblot 印迹 554.6 融合蛋白 MBP-AChR_(205)与 FactorXa 酶切产物的 ELISA 检测 55-564.7 融合蛋白MBP-AChR_(205)与抗 AChR 血清的 ELISA 反应 564.8 免疫吸附剂Amylose-MBP-AChR_(205)对 AChRAb 的结合性能 56-574.9 免疫吸附剂对肌无力病人血清中 AChRAb 及其它成分的清除
9、率 57-595 讨论59-606 参考文献 60-61 第四章乙酰胆碱受体 -亚基主要功能区在酵母中的表达纯化及免疫性质 61-771 前言 612 材料 61-622.1 工具酶和主要生化试剂 61-622.2 免疫分析试剂 622.3 酵母菌培养基 623 方法62-683.1 重组质粒的构建 62-643.2 酵母宿主菌感受态细胞的制备及转化 64-663.3 多拷贝酵母重组转化子的筛选 663.4 重组菌的 PCR 鉴定 66-673.5 重组 AChR_(211)在 P.pastorisGS115 中的分泌表达673.6 重组 AChR_(211)的纯化 673.7AChR_(21
10、1)的免疫学活性 67-683.8AChR_(211)-免疫吸附剂的制备 683.9AChR_(211)-免疫吸附剂对肌无力患者血清中 AChRAb 的清除作用 684 结果 68-744.1 重组质粒的鉴定 68-704.2 重组酵母菌的 PCR 鉴定 704.3 重组AChR_(211)的分泌表达及 Westernblot 分析 70-714.4 重组AChR_(211)的纯化及免疫活性 71-734.5AChR_(211)免疫吸附剂的制备及其对肌无力患者血清中 AChRAb 的清除 73-745 讨论 74-756参考文献 75-77 第五章蛋白质自剪接在蛋白质工程中的应用(综述)77-
11、961 前言 77-782 蛋白质自剪切现象的发现 78-793 蛋白质自剪接的术语及内蛋白子(intein)的命名 79-803.1 蛋白质自剪接术语 793.2内蛋白子的命名 79-803.3 具有归位内切酶活性的内蛋白子的命名804 内蛋白子的分布 80-815 内蛋白子的分类与性质 81-845.1 典型内蛋白子 81-835.2 微型内蛋白子 835.3 逆向剪接内蛋白子 83-846 内蛋白子自剪接机理 84-867 内蛋白子晶体结构研究概况 868 蛋白质剪接的进化 86-879 内蛋白子在蛋白质工程中的应用 87-929.1 内蛋白子协调的蛋白质间的“化学”合成 87-899.
12、2 内蛋白子协调的蛋白质聚合与环化 89-909.3 利用内蛋白子的剪切性质建立重组蛋白的一步纯化系统 90-929.4 其它 9210 参考文献 92-96 第六章内蛋白子介导合成免疫毒素 AChR_(211)-Gelonin96-1111 前言 962 材料与方法 96-992.1 材料 96-972.2 重组质粒的构建 97-982.3 重组菌的诱导表达 982.4 重组蛋白的变、复性 982.5Intein 诱导的自剪切反应及目的蛋白的一步纯化 982.6Westernblot 分析 982.7ELISA 分析 98-992.8 无细胞体系中蛋白质合成的抑制实验 993 结果与讨论 9
13、9-1093.1 表达载体的构建 99-1003.2 重组蛋白的诱导表达 100-1013.3 包涵体的变性与复性1013.4Intein 的自剪切反应 101-1033.5 表达及纯化产物的免疫活性分析 103-1053.6 重组 Gelonin 的 ELISA 分析 1053.7 重组 Gelonin 对无细胞体系蛋白质合成的抑制作用 105-1063.8Intein 介导的免疫络合物AChR_(211)-Gelonin 的构建 106-1094 讨论 1095 参考文献 109-111第七章基因疫苗 pcDNA-AChR_(211)的构建及其在 C57BL6 小鼠体内的体液免疫应答 11
14、1-1191 前言 1112 材料与方法 111-1142.1 材料与试剂 111-1122.2 重组质粒的构建及其鉴定 1122.3 重组质粒的大量提取及纯化 112-1132.4 重组质粒的免疫接种 1132.5 抗血清的制备1132.6 小鼠血清中 AChRAb 的 ELISA 检测 1132.7 小鼠组织 DNA 的提取 113-1142.8PCR 检测组织中的目的基因 1143 结果 114-1173.1 重组质粒 pcDNA-AChR_(211)的鉴定 114-1153.2 重组质粒 pcDNA-AChR_(211)的纯化及定量 1153.3 临床症状 1153.4 血清中 AChRAb的检测 115-1163.5 组织中目的基因的检测及序列测定 116-1174 讨论117-1185 参考文献 118-119 附录一略语表 119-121 附录二基本方法与技术 121-130 附录三攻读博士期间发表的论文 130-132 致谢 132-133 承诺书 133 本论文购买请联系页眉网站。本论文购买请联系页眉网站。
