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1、微生物学通报 SEP 20, 2012, 39(9): 1272 1279 Microbiology China 2012 by Institute of Microbiology, CAS 基金项目：国家科技支撑计划重点项目(No. 2007BAK36B02, 2008BAI63B06); 国家自然科学基金项目(No. 31000806); 中国白酒 169 计划; 江苏省产学研前瞻性联合研究项目(No. BY2010116); 中央高效基本科研业务费专项资金资助(No. JUSRP11013) *通讯作者：Tel: 86-510-85864112; : 收稿日期：2011-12-27;
2、 接受日期：2012-02-09 研究报告 清香型白酒固态酿造过程中酵母种群结构和 多样性分析 王薇 吴群 徐岩* (江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122) 摘 要: 【目的】探索清香型白酒固态酿造过程中酵母的种群结构和生态多样性变化规律, 为科学认识白酒酿造的过程与机制提供理论依据。【方法】 运用 WL 鉴别培养基和 26S rRNA D1/D2序列分析方法对清香型白酒 3种典型大曲和酒醅发酵过程的酵母进行分类学研究。 【结果】从清香型白酒固态酿造过程中共鉴定出 10 种酵母, 分别为 Saccharomyces cerevisiae、Issatch
3、enkia orientalis、Pichia anomala、Saccharomycopsis fibuligera、Pichia fermentans、Trichosporon asahii、Hanseniaspora osmophila、Pichia farinosa、Pichia membranifaciens 和 Clavispora lusitaniae。其中 T. asahii、C. lusitaniae、H. osmophila、P. membranifaciens、P. farinose 和 P. fermentans 为首次从清香型白酒酿造过程中分离获得的酵母种类。考察 3
4、 种典型大曲(清茬、红心、后火曲)和大茬、二茬酒醅发酵过程的酵母种群结构变化规律显示, 3 种大曲具有相同的优势菌种 S. fibuligera, 但三者酵母结构组成差异较大, 且清茬曲含有最多的酵母数量和种类。酒醅发酵过程中的酵母种群结构与3 种大曲均明显不同, 大茬和二茬酒醅酵母结构也不同, 两种酒醅发酵后期的优势酵母均为 S. cerevisiae, 而发酵前期优势酵母则分别是 H. osmophila 和 P. membranifaciens。【结论】深入研究了清香型白酒酿造过程中微生物的分布特征和规律, 对认识清香型白酒酿造过程和群体微生物的发酵机制, 以及丰富我国传统酿造食品微生物
5、的研究, 具有重要的理论和实践价值。 关键词: 清香型白酒, 酵母, 26S rRNA D1/D2, 种群结构 王薇等: 清香型白酒固态酿造过程中酵母种群结构和多样性分析 1273 http:/ Identification and analysis of yeast community structure in Chinese light-style liquor brewing process WANG Wei WU Qun XU Yan* (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Sch
6、ool of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China) Abstract: Objective This work aimed to explore yeast community structure and ecological diversity in making process of Chinese light-style liquor, which would be benificial for scien- tifically understanding of the formation mec
7、hanism of Chinese light-style liquor. Methods Yeast variety and quantity during making process of Chinese light-style liquor was investi- gated by WL medium and 26S rRNA D1/D2 region sequence analysis. Results Ten yeast species were identified as Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis, Pi
8、chia anomala, Saccharomycopsis fibuligera, Pichia fermentans, Trichosporon asahii, Hanseniaspora osmo- phila, Pichia farinosa, Pichia membranifaciens and Clavispora lusitaniae. Among them, T. asahii, P. membranifaciens, H. osmophila, P. farinose and P. fermentans were firstly isolated in Chinese lig
9、ht-style liquor. Athough the quantity of S. fibuligera dominated in three types of Daqu, yeasts ecological distribution was different. There were the most amount and varieties of yeast species in Daqu of Qincha. Yeast community structure of fermented grain was also different from that of Daqu and di
10、fference also existed between fermented grain of Dacha and Ercha. S. cerevisiae was dominant at later stage of liquor fermentation, while the dominant species in Dacha and Ercha were H. osmophila and P. membranifaciens at early stage, respec- tively. Conclusion This work deeply studied the yeast dis
11、tribution characteristics and com- munity structure in making process of Chinese light-style liquor, which would show great value in scientifically understanding of the formation mechanism of Chinese light-style liquor. Keywords: Chinese light-style liquor, Yeast, 26S rRNA D1/D2, Community structure
12、 清香型白酒是我国最古老的酒种之一, 具有清香纯正, 醇甜柔和, 自然谐调, 余味爽净的特点。它的优良品质与其微生物群落和酿造工艺密切相关。其生产包括制曲和发酵两个过程。在制曲过程中, 3 种不同大曲依靠自然界各种微生物富集到用淀粉质原料制成的曲坯上, 经过培养、贮藏, 成为成品大曲。在发酵过程中, 大茬、二茬酒醅依靠大曲提供的微生物进行多微共酵, 形成复杂的白酒风味成分1。但是由于清香型白酒酿造过程复杂, 其酿造机制目前并不清晰。微生物是白酒酿造的关键因素, 认识清香型白酒酿造过程中微生物的变化规律是科学认识白酒酿造过程与机制的必要途径, 对白酒酿造技术的发展也具有重要作用。 酵母是饮料酒酿
13、造过程中的重要功能微生物, 它不仅影响酒的产量, 还影响酒的质量24。目前国际上对饮料酒酿造酵母的研究已非常深入, 例如在葡萄酒酿造中已发现了 18 个属, 70 多个种的相关酵母, 并且清晰认识了功能酵母在酿造中的变化规律5。然而, 目前对于中国白酒的1274 微生物学通报 2012, Vol.39, No.9 http:/ 典型代表清香型白酒固态酿造中酵母的认识并不清晰。清香型白酒酿造属于开放式的多菌种固态发酵过程, 与国外其它饮料酒相比而言, 其酿造酵母的种类及其变化规律更具复杂性。尽管清香型白酒酒醅发酵过程中酵母的种类以及酵母总数的变化趋势已有相关报道6, 但是总体而言仍处于起步阶段,
14、 而且目前对于整个酿造过程中酵母生态分布和种群结构变化规律仍然不够清楚。 近年来, 随着 DNA 序列分析技术的日趋成熟和简易化, 酵母 26S rRNA 基因的序列分析已经被广泛应用于酵母的分类鉴定以及多样性研究78, 这使得酵母的分类学研究更加快捷和准确。本文结合酵母常用鉴别培养基WL 鉴别培养基, 运用26S rRNA D1/D2序列分析方法, 系统而准确地研究了酵母菌群在清香型白酒 3 种典型大曲和酒醅酿造过程的生态分布和种群结构, 为进一步解析清香型白酒酵母功能、筛选适合清香型白酒酿造的优良酵母奠定基础。 1 材料与方法材料与方法 1.1 样品 某清香型白酒厂三种典型大曲(储存 60
15、 d 的清茬曲、红心曲、后火曲)和大茬、二茬酒醅(发酵 0、2、5、8、10、15、20、25 d 样品), 所有样品均 4 C 保藏。 1.2 培养基 WL 鉴别培养基配方见文献9。 1.3 酵母的分类10 将白酒大茬、二茬样品梯度稀释后均匀涂布于 WL 培养基固体平板上, 根据酵母在 WL 固体平板上的颜色和形态, 对酵母进行分类。 1.4 基因组总 DNA 的提取 采用玻璃珠法11, 所用试剂均购自 TaKaRa公司。 1.5 26S rRNA D1/D2 基因的扩增与测序 PCR 扩增程序: 94 C 4 min; 94 C 45 s, 55 C 45 s, 72 C 1 min, 共 35 个循环; 72 C 10 min。电泳确认目标产物有无及效果。 所得 PCR 产物经纯化送交上海生物工程技术服务有限公司测序。 2 结果与讨论结果与讨论 2.1 WL 鉴别培养基初步分类 WL 培养基是一种初步鉴定培养基, 主要是基于菌落颜色及菌落形态来区分酵母, 广泛用于葡萄酒酿造过程中酵母的分类研究12。本试验以WL 培养基对清香型白酒大曲和酒醅样品进行研究, 共分离得到 398 株酵母, WL 培养基分类结果如表 l 所示。通过分类可初步将清香型白酒 3 种典型大曲中的酵母分为 13 类(图 1)。 2.2 26S rRNA D1/D2 区的序列分析 根据
