生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, April 25; 27(4): 531−538 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. Received: July 27, 2010; Accepted: October 9, 2010 Supported by: National S Fax: +86-595-22690516; E-mail: lyh4444@ 国家重大新药创制专项 (No. 2009ZX09103-643)，国家自然科学基金 (No. 30900822)，福建省重点项目 (No. 2010Y0036)，华侨大学校基金 (No. 07BS301) 资助 综 述 腺相关病毒的衣壳装配和 DNA 衣壳化机制 王启钊1,2，吕颖慧1,2，李招发1,2，刁勇1,2，许瑞安1,2 1 华侨大学分子药物学研究所，泉州 362021 2 分子药物教育部工程研究中心，泉州 362021 摘 要: 重组腺相关病毒载体 (rAAV) 是基因治疗临床应用载体的选择之一。
在简述野生型 AAV 基因组结构和复制机制的基础上，阐述了 AAV 包装过程中两个主要事件：衣壳蛋白的装配和基因组 DNA 的衣壳化虽然对 AAV 的包装机制总体上已有一定的认识，但其详细的分子机制、构效关系仍需完善和充实AAV 病毒本身相关机制的深入研究有助于改善 rAAV 载体的制备技术，促进 rAAV 基因药物研发 关键词: 腺相关病毒，装配，衣壳化，基因治疗 Capsid assembly and DNA encapsidation of adeno-associated virus Qizhao Wang1,2, Yinghui Lü1,2, Zhaofa Li1,2, Yong Diao1,2, and Rui’an Xu1,2 1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China 2 Molecular Medicine Engineering Research Center, Ministry of Education, Quanzhou 362021, China Abstract: Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) have been widely used as gene therapy vectors in clinical trials. Here, we reviewed the genomic structures and replication mechanisms of wt-AAV. Then, the assembly of capsid and the encapsidation of genomic DNA, two major events during AAV pakaging, was discussed in detail. Although the overall pattern of virus assembly and encapsidation is known, the molecular mechanisms and the structure-function relationship involved in these processes are not well understood. Further elucidatation of these processes may improve the production technology of rAAV and develop gene drug based on rAAV. Keywords: adeno-assoicated virus, assembly, encapsidation, gene therapy 532 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech April 25, 2011 Vol.27 No.4 J 腺相关病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 为细小病毒家族成员，因其为复制缺陷型病毒、基因结构简单、与寄主染色体定点整合，且迄今未发现与任何人类疾病相关，被认为是介导基因转移的理想载体。
此外，AAV 还具有免疫原性弱、宿主范围广、理化性质稳定、长期表达外源基因等优点[1]在上世纪80年代重组AAV (rAAV) 载体制备方法取得进展之后，研究人员开始逐步将其应用于临床治疗研究，并证明了该载体的有效性 (http://www. 载体存在的一些问题逐渐暴露，如细胞毒性、免疫原性、整合带来的安全性、包装容量限制、产业化制备技术等[2]理想和现实的差距促使科研人员开始重新将目光聚集于 AAV 病毒本身的一些特性，以期从源头上寻找解决问题的答案本文在简述野生型 AAV 基因组结构和复制机制的基础上， 阐述了 AAV 包装过程中两个主要事件： 衣壳蛋白的装配和基因组 DNA 的衣壳化 1 AAV基因组结构与复制机理 1.1 AAV 的基因组结构 了解 AAV 的基因组结构是阐明 AAV 复制机理与包装机制的基础目前大多数基因治疗用 rAAV以AAV2基因组为骨架 (图1) AAV2基因组为4 679个核苷酸的单链 DNA (ssDNA)，两末端为倒转重复序列 (Inverted terminal repeat，ITR)，是 AAV 整合、复制、拯救和包装所必须的顺式作用元件，并具有转录启动子的活性。
ITR 序列之间为病毒编码区，含有两个开放阅读框架，目前认为可表达 4 个 Rep蛋白、3 个 Cap 蛋白及一个 AAP 蛋白 AAV2 DNA 两端的 ITR 由 145 个核苷酸组成，在 ITR 二级结构中，由 3 段回文结构组成 T 型空间结构B-B'和 C-C'构成 T 的顶端，A-A'构成 T 的长臂ITR 上有 2 个 Rep 蛋白结合位点，分别为 RBE和 RBE’，AAV Rep78 和 Rep68 蛋白能结合其上另外， ITR上还有一个末端断裂位点 (Terminal resolution site，Trs) 和一个 D 序列，它们在 DNA 的复制过程中具有非常重要的作用[3] AAV2 Rep 基因编码至少 4 种非结构蛋白：Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40由 p5 启动子起始的 2 种 mRNA 翻译成 Rep78 和 Rep68；p19 启动子起始的 2 种 mRNA 翻译成 Rep52 和 Rep40Rep52和 Rep40 蛋白 C 末端的氨基酸序列分别与 Rep78 和Rep68 相同 (图 1)Rep78 和 Rep68 蛋白与 AAV 基因表达的正负调控有关。
这两种蛋白都可与 ITR 中的 RBE 结合Rep78/Rep68 具有 ATP 酶和螺旋酶的功能当其与 ITR 结合时又能在 Trs 处切割基因组DNA，使其产生缺口这两种蛋白对于 AAV 生活周期的每一时期都是必需的Rep52 和 Rep40 参与了病毒的装配， 它们在病毒双链 DNA(dsDNA) 合成中是不需要的，但在 ssDNA 和病毒颗粒的累积中则是必需的[4] 一直以来，Cap 基因被认为只编码衣壳蛋白，其转录从 p40 启动子开始，形成约 2.6 kb 和 2.3 kb mRNA，拼接后分别编码 3 个结构蛋白 VP1、VP2和 VP3，分子量分别为 87、73、61 kDa，在成熟病毒颗粒中的比例大约为 1∶1∶8VPs 蛋白的 C 末端具有相同的氨基酸序列，VP2 的 N 端比 VP 3 多65 个氨基酸，而 VP1 的 N 端比 VP2 还要多 137 个氨基酸VP2 和 VP3 由 2.3 kb 的 mRNA 翻译而来，而 VP1 则由 2.6 kb 的 mRNA 翻译VP1、VP2 和VP3 的起始密码子分别为 AUG(2203)、ACG(2614) 和 AUG(2809)， 其中 ACG(2614) 是一个真核细胞特有的起始密码子，它的启动能力低于 AUG。
如果将Cap 基因中的 ACG(2614) 突变成 AUG(2614)， 可提高 VP2 表达，但会降低 VP3 表达[5]VP1 N 末端的PLA2 活性在 AAV 感染过程中起到关键作用[6]，而VP3 对于 AAV 组装是必需的[7] 新近研究发现， Cap基因还编码另外一个蛋白，称为装配激活蛋白 (Assembly-activating protein， AAP) AAP 是由 2.3 kb mRNA 上的 ACG(2729) 密码子起始翻译， 蛋白大小为 23 kDa[8]AAP 主要定位于细胞核内，AAP 不但能帮助 VPs 进入细胞核，并可能为 VPs 装配提供支架，或协助 VPs 进行正确折叠 王启钊等: 腺相关病毒的衣壳装配和 DNA 衣壳化机制 533 J 图 1 AAV 基因组结构 Fig. 1 Genomic structure of AAV. 1.2 AAV DNA 复制机理 AAV 复制时，以自身 3′端的序列作为引物，产生两个等长的分子 (母链/子链)， 两者具有一个共价连接的末端之后，Rep78 和 Rep68 发挥核酸内切酶的作用，在母链 Trs 位点产生一个缺口。
在 T 型结构顶端的 RBE’，能维持这一结构的稳定性新产生的-3′OH 可以作为 DNA 聚合酶的底物，合成新的ITR 序列 最后， ITR 退火形成发夹结构， 并将-3′OH重新置于单链取代合成的起始位点经过新一轮的复制，可以形成一个新的 AAV 病毒以及一个母链/子链共存的二聚体如果其中一个 ITR 中的缺口产生失败， 那么产生的 AAV 病毒将可以二聚体的形式稳定存在，这是构建带有双链基因组的自身互补型AAV 载体的基础[3] 除了本身基因外，AAV 还需借助其他基因完成生命周期，提供基因有腺病毒 (Ad) 和单纯疱疹病毒(HSV)以 Ad 为例，E1a 蛋白可激活 Ad 早期基因及 AAV Rep 和 Cap 基因，并诱导寄主细胞进入 S期；E1b 和 E4orf6 的作用是形成复合物，参与 AAV基因组由单链到双链的转变以及 AAV mRNA 从核内运送到核外的过程；E2a 是一种单链 DNA 结合蛋白， 可以加速 AAV DNA 的合成过程 AVI RNA 的作用则是降低干扰素效应对寄主细胞翻译的影响[4] 2 AAV包装机制 虽然 AAV 的结构非常简单， 人们对其复制机理也已有一定程度了解， 但是目前对于 AAV 衣壳的装配过程以及基因组进入衣壳的过程还知之甚少。
现有的 AAV 包装机制模型在以下几个方面达成了基本共识第一，ssDNA 通过某种机制导入到已经形式的病毒衣壳内； 第二， Rep 蛋白连接 ssDNA 的 ITR以及 Cap 蛋白，将 ssDNA 定位于衣壳表面；第三，ssDNA的移动需要 Rep蛋白的螺旋酶活性和 ATPase 活性； 第四， ssDNA 进入衣壳的方向是 3′−。