生物芯片——希望之光

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1、生物芯片希望之光 基因组研究的目的是提供生物学家等同于化学元素周期表作用的“生物元素周期表” 标明组成生命体所有基因的结构及功能，并能阐明其相互内在关系及多层次分类的生物 信息表。而在短短的十年前，人们还认为这仅仅是个幻想。化学元素周期表仅由数百种元 素组成，但由其所形成的生物有机体数量却是巨大的数以千计的细菌及千万种的哺乳 动物。而基因组图谱的测序则远远地超过之而占据主导地位：目前，已经达到百万碱基， 在不远的将来，将达到十亿碱基的水平。 下一步目标是揭示其内在关系和规则。化学元素周期表以元素的特性定义其在表中的 行列位置，并进而能预示元素亚原子结构秘密。依此类推，组成生物体的约十万个基因也

2、 会根据其特性而排列组合。生物元素周期表将不局限于二维，其在生物发育及基因表达的 各阶段具有共性和个性；编码及调节区中主要的 DNA 序列；各物种及亚群中多样性变化； 发育、生理反应及疾病时的 RNA 表达的时间及地点；蛋白产物亚细胞定位及分子间相互 作用。而传统的从基因到基因（gene-by-gene）的研究方法已经无法完成以上如此复杂的工 作，非常有必要对生物进程从全局的观念（global views ）进行理解，也就是同时解析生物 体相关所有组份。 生物芯片首次提供了对这种全局观念的解决之道。它提供了系统地揭示 DNA 和 RNA 变化的方法，有可能成为未来生物学研究和临床诊断的通用手段

3、。其广阔的应用前景极大 地吸引了众多的公共及私人企业中的目光，将其发展的重点定位在以生物芯片为基础的生 物信息学研究和开发领域之中。 图 1 技术背景：追朔到一个多世纪之前，EdSouthern 先生发现被标记的核酸分子能够与另一被固化的 核酸分子酸对杂交。因此，Southernblot 可被看做是最早的生物芯片。稍后，人们又发明了 以各种膜片为基础的克隆库扫描技术，它引入了克隆与杂交信号对应关系的概念。再一次的进步是克隆库的分格处理技术，即先将其分布在微孔板的微孔中，然后粘贴到膜片 的固定位置上，这样，每个克隆可以被识别并且其相关特征也会不断积累。这之后，大量 的实验随之兴起，通过将 mRN

4、A 与分格固化在尼龙膜上的 cDNA 库杂交，多家实验室进行 了表达分析实验。虽然其思路合理，但要真正实现仍然有许多困难。两种关键技术的发明排除了生物芯片实用化的障碍，并使得其应用突飞猛进，日新月 异。其一是非孔的固相支持物如玻璃片的使用，它使得微量和荧光检测技术的实现成为可 能。可以通过高速机械手和连续点样技术将 10,000 个 cDNA 均匀等距离地点在一块常用的 显微镜载玻上，并与双标记的探针杂交。信号的强弱用共聚焦的芯片检测器测量（图 1） ， Pat Brown 及其同事所最先发明了这种方法。其二是高密度原位合成寡聚核甘酸的方法 Steve Fodor 及同事采用半导体制造中的光板

5、印刷屏蔽技术而生产芯片，其在仅 20 平方微 米上可以合成达 400，000 个目的寡聚核甘酸。其它还有采用微喷技术进行原位合成的尝试。 图 2就目前生物芯片制作点样系统的设计性能而言，应该达到的指标包括：多针头自动同 时取样，取样板既可以是 96 孔板，也可以是 384 孔板；单针取样量为 250 到 500n1；每次 点样量为 100 到 150ul；点样直径为 100 到 150um ；系统点样分辨率达到 10um；系统可以 直接通过程序控制进行连续点样操作；为使点样精度保持恒定，其固相介质如玻璃片必须 通过适当机制进行位置固定；各类型针尖必须具备单次取样连续点样的功能。系统最重要 的要

6、求是必须达到高通量和高精度的要求。目前已经商业化的产品中，以 Cartesian 公司 Pixsys 系列点样产品最具代表性。完全能够满足对生物芯片制作系统设计的完整要求。新一代生物芯片技术目前仍然处于萌芽时期。原因在于众多的科学文献仅仅在探讨生 物芯片技术本身而不是其真正应用研究工作，其技术手段本身也仅在少数几家实验室建立， 对多数实验室来说，组建生物芯片设备及后期购买芯片设备的投资也相当昂贵。但无论如何，随着经济状况的进一步改善，芯片市场的自由竞争的加剧，以及时间的延续，正像最 初计算机 CPU 的发展过程一样，以上的问题会得到根本的解决。 图 3 RNA 表达研究目前大多数有关生物芯片的

7、研究项目主要集中在对 RNA 表达水平的检测。其突出的 进展体现在对 Saccharomycescerevisiae 酵母的研究中。随着酵母全基因组序列的探明，人 们已经制作了包含全部酵母基因的寡取核甘酸及 cDNA 芯片 （图 2） ，并将其应用在 RNA 的表达检测中，其检测的综合费用明显低于常规的单细胞信息的传统方法。研究酵母的遗 传学家目前正致力于探讨诸如酵母有丝分裂和减数分裂等基础生理过程的 RNA 全局表达 研究。对哺乳类动物的基因组研究，芯片的研究方法同样适用。包括 5，000 到 10，000 个基 因的芯片已经普遍使用，目前的方法已经达到能够十分可靠地检测单一哺乳类细胞中的数

8、 个拷贝的水平。下一步的工作是祛除假阳性和增加灵敏度，可以十分肯定地预测，在下个 世纪的不长时间内，研究者将可以购买包含人类及小鼠的 100，000 全基因组的标准寡聚核 甘酸和 cDNA 生物芯片。 事实上，真正的挑战并不是表达芯片本身，而在于如何开发相应的实验手段以真正最 大限度地利用这种全局的研究策略。这是一种技术和观念的统一。一些最重要的生物学应用包括对非常微小的靶组织的研究例如，肢发育过程中， 顶端外胚层脊；处于基质细胞群中的肿瘤细胞；皮质中特殊类型神经元细胞。这就非常需 要一种可靠的定量扩增手段来保证实验结果的可重复性。实验操作步骤也需要认真对待。任何微环境（例如培养板在孵箱中的位

9、置，或者具有 实验的日期等）的变化都将导致对全局表达（GLOBALEXPRESSION）研究的误判，原因 在于人们是从十万个基因中去发现当中微小的亚类的变异，最著名的是针对 aficionados 的 单一样品的重复杂交实验，发现相隔数周的“相同” 实验，其杂交特性却有明显的不同。然而，生物芯片带给人们的最大优势是分析及处理大量的数据。早期的表达实验研究 是比较仅两个样品，目的是识别其基因的表达水平的差异（例如肿瘤细胞系的代谢及非代 谢时期） 。深入的生物这研究则体现在对数种样品的数据库分析工作中，例如对数种细胞系 进行独立的多种生长因子的处理时的多时间点数据库分析。每种基因定定义 K 维空间

10、中的一点（在这里 K 是被测样品数目） ，其功能的相似性则可能揭示出它们在该空间中的依存 关系（定义为“ 簇” ：CLUSTERS ） 。工作于此的计算机科学家们已经想出了相关对策以对这 些令人眩晕的簇进行分类，并预测和观察其在多维空间中的联系，而这些对策和方法均来 自于已有的内在关系的模式类型表达的基础上。只有通过后期的大量实验以证明哪种数据 库和分析方法是最有意义和有效的。 图 4到底起因如何从各种关联中推断？这类似于根据晶体管对各种输入的反应的读出数据 而推断微处理器的设计方案。但这并不是一种严格的数学公式。生物芯片将会异常的复杂， 但还是会以生物现象为其根本的基础，尤其是在应用生物原理

11、和技术而去除了特殊导线的 生物电路上，其广阔的应用前景将导致大批年轻计算机科学家涌入到生物芯片的领域之中。 DNA 变异生物芯片技术亦可被应用于对 DNA 的研究。早期的研究工作是对突变和多样性的识 别和基因分型（genotyping ） 。相比于 RNA 表达监测分析，这方面的应用存在许多困难， 诸多课题需要进一步的探讨。 识别 DNA 变异的工作将主要由寡聚核甘酸生物芯片完成。通过高密度的合成技术，人们 可以构架特异的芯片，并用其来扫描突变的靶序列。每个 25-mer 长的有重叠的序列被四个 互补的寡聚核甘酸探针覆盖，其探针仅在中间位置的核甘酸种类不同（A，T，C 或 G） 。 一个含有预

12、测序列的扩增产物将只与预测的序列进行杂交，而序列的变异将极大地影响杂 交模式。这种类型的芯片已经被用来检测各类靶对象的变异例如，HIV 基因组，人类线粒 体及基因编码的 p53。在这类特殊实验中，所有实验可被优化以达到极高的特异性的灵敏 度。该类方法现已被用于大量研究探索中。例如，使用 100 个此类芯片的组合对 21，000 个序列表达标签（STSs）中的单核甘酸多样性（SNPs ）进行扫描分析，此 STS 已经覆盖 了多于 2Mb 的基因组 DNA。这类芯片功能很强，但也有不完善之处。在高通量研究应中， 纯合子的检测比较可靠，而杂合子则较易丢失。单碱基替换因为仅与特定位置的四种碱基 之一匹

13、配而使得检测可靠，而除非相应探针已在芯片上存在，否则缺失和插入的碱基将很 难特异识别。理论上，大量的区域可被用于进行 DNA 变异检测。如果将目前的芯片点样量减少 20 倍达到 1um 的话，则 100Mb 基因组可以仅在一个 2cm2cm 面积的芯片上检测，这样，整 个人类全基因组将只用 30 个芯片既可完成。要想实验如此的计划，需要解决一系列问题。首先，对特殊靶对象扩增目的的实现，目前的技术可以完成全部哺乳类 RNA 的杂交，但 却无法完成比之 100 倍复杂的基因组 DNA 杂交。每一个靶位点都需要开发其特异的 PCR 扩增程序。其次，极低的微量实验也需要开发更为敏感的标记和检测手段。对

14、大量已知序列 DNA 变异的基因分型（genotyping） ，则是另外一个课题。寡聚核甘 酸芯片技术已经可以实现在多个位点合成包含等位基因特异检测基因的芯片。然而，更理 想的方法是源自酵母芯片应用的方式，构架一个包含标签序列的通用生物芯片。如果对应 于每个位点的引物其末端是独特的标签序列，则基因分型（genotyping）反应可以完成并可 与这种通用芯片杂交，这样就可以保证正确退火并杂交到相应位点。本研究组现已开发了 这种单碱基荧光标记扩充方法，也有其它研究人员使用了类似的寡聚实验方法。这种能用 的芯片技术既可以通过寡聚核甘酸芯片技术实验，也可以通过生物芯片点样系统实现。目前，大量的研究都围

15、绕在诸如 SNPs 等的人类基因组变异上，已有数字生物技术公 司预计投资十亿美元制作 SNPs 的数据库，并希望制药公司能通过购买其数据库知识产权 而赢得巨大利润。然而，就人类的群体遗传学研究而言，仍然存在着一些基础疑问，这其 中包括诸如引起人类疾病的公共遗传变异特征；横跨在人类基因组和自然界的种群内及种 群间的非平衡性链接强度。这些问题必须得到彻底解决，才能将有关 SNPs 真正应用到科 学研究及临床医学诊断中来。由于核酸芯片技术正日益深入到研究者的每一个角落，技术人员已经致力于发展蛋白 芯片，抗体芯片，细胞芯片，及其它有关技术。而广大分子生物学家正竭尽全力研究和探 讨“生物周期表” 。而当前生物芯片的研究水平也只是刚刚达到二十世纪初的对化学元素周 期表认知的类似水平，正如诸如高温超导等化学现象所提醒我们的那样，一定存在即使化 学元素周期表也没有揭示出来的自然界的千奇百态。正视“生物周期表”认知过程，一定需 要几辈生物学家们的不懈努力。生物芯片一出现，就显示出了强大的生命力，其发展速度以及其中所运用的技术令人 瞩目，展示的应用前景使人鼓舞，它顺应了人类基因组计划实施，必将给生命科学研究及 开发领域带来无法预知的广阔空间。 图 5