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1、内源性潜在转化生长因子-1 的光激活引导（direct）牙干细胞分化再生干细胞生物学领域的快速进展使得再生医学界最近做了许多利用干细胞充当治疗因子的尝试。但是，目前大多数再生途径所用的体外活体细胞操作技术，在临床转化方面，有一系列技术和管理上的障碍，而即使是用外源因子诱导组织内干细胞分化这种较为简单的途径，也会带来显著的不想要的（off-target）副作用。我们发现非电离的低能量激光（LPL）可以代替其它途径，充当一种侵袭性最小的活化工具，以激活一种内源性潜在转化生长因子复合物转化生长因子 1（TGF-1 ） ，从而让宿主干细胞继发性分化，促进组织再生。LPL 处理可以产生活性氧（ ROS）
2、并呈剂量依赖关系，这一过程通过（ LAP253位上的）一个特殊的蛋氨酸残根依次激活潜在 TGF-1（ LTGF-1 ） 。激光激活的 TGF-1足以使离体人类牙干细胞分化。更进一步的是，小鼠牙盖髓模型显示在 LPL 处理后，牙本质再生的速度显著提高。在 TGF- 受体（TGF-R）被条件性敲除（DSPP CreTGF-R fl/fl）的小鼠或被给予了 TGF-R抑制剂的野生型小鼠中，上述活体结果是被剥夺的。这些发现提示 TGF- 在介导 LPL 诱导的牙组织再生方面起着枢纽作用。更广义地说，这项工作勾勒出了用光激活内源性信号（cue）控制体内干细胞，从而应用于临床再生医学的实践基础。INTRO
3、DUCTION再生医学界最近致力于将干细胞引导分化成特定谱系的功能性细胞，这种功能性细胞可以促进组织的修复和机化。干细胞治疗在治疗很多疾病方面极有诱惑力，包括牙科疾病（例如蛀牙以及牙龈病） ，这属于目前最普遍的健康问题。目前临床的牙科的主要关注点在恢复性方法，涉及到植入材料的放置。但组织再生是一个很有吸引力的选项，因为单纯的材料会随着时间而衰退，并且也不能提供组织的全部功能（1） 。目前已经探索了诱导干细胞行为的一些不同的生物学及生物工程学途径。干细胞疗法临床应用的典型例子就是培养特定患者的细胞，然后将其重新诱导成特定的结构上的一部分。与之相比，外源性形态产生素可能进入组织，使固有的干细胞动员
4、，并促使其产生特定生物学功能。无论是哪种情况，外源性材料必须按严格的空间和时间限制规则进入身体，这种限制对其临床推广产生了显著的技术，调控，经济以及生物学上（副作用）的障碍（2） 。通过激活内源性形态产生素从而命中固有干细胞池，这种方法有可能绕开再生医学现行途径中的许多限制，造成这一领域的革命（3） 。在这些内源性因子中，具有生理作用的潜在生长因子复合物，例如转化生长因子 （TGF-）超家族的成员们，可以充当强有力的信号。TGF- 作为一种潜在复合物分泌，它的活化是其生理功能中的关键步骤（4） 。TGF- 超家族是由 23 个不同的基因编码的，包括 TGF- ， 骨成型蛋白 （BMP ） ，
5、活化素 ，枢纽蛋白 （Nodal） ， 抑制素 ，以及 生长分化因子 （GDF ） （5 ，6 ）它们在调控干细胞多能性和分化方面的相互作用及其复合物背景依赖性作用，已经被各种实验模型很好地揭示了。近期的研究强调了 TGF- 信号通路在干细胞分化过程中作为主要调节因子的角色（7，8 ） 。通过对 TGF- 受体（TGF-R）的特异性抑制和继发性的谱系分化标志物表达的缺失从而实现对 Oct4 和 Nanog 表达的诱导，这一事实使人们认识到了 TGF- 信号通路在干细胞多能性和分化方面的核心角色。除此之外，TGF- 超家族成员们在牙的发育中扮演着核心角色，特别是在本实验所用的模型的牙髓-牙本质的
6、病理生理过程中，并且其还是牙髓再生中最有希望的信号之一。人们已经描述了潜在 TGF-（LTGF-）的几种激活方法，包括极端的 pH，温度，超声，整合蛋白的结合，电离辐射，以及诸如血小板反应蛋白（thrombospondin）-1 这样的蛋白酶（14） 。出于实践及安全上的考虑，这些 TGF- 引发物在临床应用上有着不同的吸引力。光照是一种很吸引人的（激活）方法，但直到目前，对它的应用主要还是集中于它的摧毁性光毒性作用，例如杀死肿瘤细胞。与这些方法相比，人们已经注意到低能量激光（LPL）治疗可以减少疼痛和炎症，促进创口恢复，这类作用统称为光生物调节作用（15） 。人们曾偶发性注意到 LPL 治疗
7、对心脏、皮肤、肺以及神经组织的促再生作用（16） 。已有资料提示这些再生反应是由发生在干细胞中的直接或间接作用所介导的（17-19） ，但激光治疗与干细胞生物学之间的直接联系尚不清楚。本文中，我们评估了 LPL 引导牙干细胞分化以进行牙本质再生的能力，并研究了这一过程中涉及到的详细的分子机制。LPL 可能产生了活性氧簇（ROS，reactive oxygen species） ，ROS 又接着通过潜在相关肽（LAP，latency-associated peptide）上一个特殊的蛋氨酸激活LTGF-1 。在这些研究中我们应用了啮齿类动物牙本质修复模型，这一模型的口腔便于进入，里面有大量的内源
8、性成年小鼠牙干细胞。RESULTSLPL 诱导第三期牙本质形成用机械方法暴露了两只小鼠上颌第一臼齿的牙髓：一处接受 LPL 治疗，另一处则做对照组（没有激光） ；这两处牙齿都接受了填充（Fig.1A） 。通过髓过氧化物酶探针发现，LPL治疗在 24 小时内对炎症反应无显著影响（Fig.1B 及 fig.S1A） 。在本模型中我们用氢氧化钙Ca(OH)2敷料充当第三期牙本质诱导的阳性参照物（fig.S1B） 。对第三期牙本质的诱导，我们用高分辨微机断层扫描（CT）进行评估（Fig.1C） 。我们通过 CT （Fig 1D）和组织学观察（Fig.1E fig.S1C）发现，在经过 LPL 治疗 1
9、2 周后，与对照组相比，第三期牙本质的量增加了。第三期牙本质的特征是无组织，骨样（骨性牙本质）形态，以及完全不同的矿物沉积和解剖学位置，正如我们在经 Ca(OH)2 处理的样本中所注意到的那样（fig.S2） 。用能量色散光谱仪（EDS ） （Fig.1F）和 Raman 显微镜（Fig.1G ）观察评估发现，经 LPL 诱导生成的第三期牙本质与经 Ca(OH)2 处理的样本有同样的沉积。以上发现提示 LPL 处理诱导了小鼠牙髓内第三期牙本质的形成。LPL 处理产生了 ROS接下来我们调查了 LPL 处理的再生作用的分子机制。 LPL 诱导的 ROS 的产生情况用荧光探针来评估（table S
10、1） 。貂肺上皮细胞（ Mv1Lu）经 LPL 处理后我们观察到过氧化物和过氧化氢（H 2O2）增高，增高程度与 LPL 呈剂量依赖关系，而 Mv1Lu 和小鼠牙髓细胞小鼠牙髓乳头状细胞 23（MDPC-23） 中的一氧化碳（NO）均无改变（Fig.2,A to D） 。加入 ROS 净化剂 N-乙酰半胱氨酸（ NAC）再培育，则经 LPL 处理后观察到的 ROS 减少（Fig.2 ，A and C） 。我们用抗霉素 A，一种能抑制产 ROS 线粒体氧化磷酸酶的物质，来充当阳性参照物。接下来我们用 LPL 处理胎牛血清（ FBS）的脱细胞溶液。我们注意到有超氧化物，H2O2，以及羟基产生，与
11、LPL 呈剂量依赖关系（Fig.2 E and F, and fig.S3A） 。用被氘取代的水稀释血清后，由于介电常数和弥散系数的不同增加了 ROS 的存在期，使得 LPL 诱导的 ROS显著增加（fig.S3B） 。过渡金属形成核心质子供体复合物（core proton donor complexes）使光子更容易被吸收。用螯合树脂（Chelex 树脂）预处理血清以耗竭其中的过渡金属离子，之后再用 LPL 处理，发现 ROS 的产生明显减少（fig. S3C） 。LPL-ROS 激活 LTGF-由于 LPL 可以在离体情况下产生 ROS，而这类反应中间化学物质在调节生物复合物方面扮演的角色
12、已经有深入的研究。我们通过 IAEDANS，一种与游离半胱氨酸结合的荧光染料，观察到用 LPL 处理 FBS 后，荧光增加，提示 LPL 诱导了血清成分中某种复合物的构象变化（Fig.3A） 。为了找出可能发生改变的成分，我们将 IAEDANS 标记过的血清样本进行凝胶电泳，与对照组相比，LPL 处理过的样本中发现了不一样的复合物（Fig.3B,左侧图） 。一条主带是血清白蛋白，它发生了氧化还原敏感性构象改变（20） 。免疫印记发现其它带是TGF- 的不同形式（Fig.3B, 右侧图） ，正如之前的研究所预料的那样。在 TGF-1 的活化过程中，二硫键断裂，暴露出游离半胱氨酸（23） ；因此，
13、这一发现提示 LPL 处理引起了TGF-1 的活化。我们也用纯化重组人 LTGF-1 （rhLTGF- 1）溶液做了测试，结果表明LPL 处理可以直接调节其构象结构（Fig.3A） 。LPL 直接激活 LTGF-1 的能力得到了进一步的描述。血清和重组 LTGF-1 用 LPL 处理，用酶联免疫吸附法（ELISA）评估其活化。LPL 激活了 LTGF-1 的两种不同形式，并呈剂量依赖关系（Fig.3C and fig.S4A） 。更深层的是，TGF- 指示（p3TP-luc）MvLu1 细胞经 LPL 处理后，荧光素酶活性增加（fig.S4B） ，提示经 LPL 激活的 TGF- 具有生物学作
14、用。在 LPL 处理之前，用 ROS 抑制剂（NAC）或 TGF-1R（SB431542 ）进行预处理，可以部分减少荧光素酶指示剂的活性（fig.S4B） 。这类抑制剂之所以不能让指示剂的活性完全消失，似乎是由 p3TP 指示剂中的 AP1（activator protein 1）成分所致，这种成分使得指示剂被其它生长因子反式激活（The inability of these inhibitors to provide complete loss of reporter activity is likely due to AP-1 (activator protein 1) elements
15、in the p3TP reporter that are amenable to transactivation by other growth factors） （24） 。我们评估了 LPL 产生的独立 ROS也就是过氧化物，H 2O2，以及羟基激活 LTGF-1 的能力。上述三种氧簇都是在血清中被单独产生的（ table S1） ，并具有激活 LTGF- 复合物的能力（fig. S4C） 。TGF- 1 上赋予 ROS 敏感性的一个关键残基是位于潜在相关肽（LAP）第 253 位上的甲硫氨酸，其突变为丙氨酸（M253A）将使对 ROS 的敏感性消失（25 ） 。经过稳定转染的小鼠胚胎成
16、纤维细胞（MEFs）既可以分泌完整的野生型 LTGF-1 ，也可以分泌对 ROS 不敏感型 LTGF-1 突变体，我们用这种细胞来评估经 LPL 处理产生的 ROS 对 LTGF-1 的激活作用。这两个细胞系都分泌等量的 LTGF-1 ，并且都可用常规化学方法激活（fig.S4D） 。经 LPL 处理时，表达野生型 LTGF-1 的 MEFs 中的 p-Smad2 强烈增加，但表达突变 LTGF-1 的 MEFs 则没有出现这种增长（Fig.3D） 。为突变 MEFs 直接添加重组 TGF-1 可诱导 p-Smad2，巩固这些细胞中 TGF- 信号转导途径的完整性。对来自突变型 MEFs 的条件培养基用 H2O2 处理后，与来自野生型 MEFs 的条件培养基相比，其TGF- 活性降低（fig.S4, D and E） 。以上这些结果合起来提示经 LPL 处理后，LAP 中的 ROS敏感性是 TGF- 活化的必要条件。LP
