《实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节（16页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1实时定量 PCR 分析小鼠树突状细胞 TLR4 mRNA表达及地塞米松的调节作者：张罕, 吕喆, 李冬妹 , 何秀娟, 伍香玲 , 胡永秀【摘要 】 目的: 建立检测小鼠 Toll 样受体 4（TLR4）mRNA表达水平的 SYBR Green实时定量 PCR 实验; 观察小鼠骨髓源树突状细胞（DC）发育成熟过程中 TLR4 mRNA 表达水平的动态变化以及地塞米松（DEX）对 DC TLR4 mRNA 表达的影响。方法: （1）用细胞因子定向诱导的方法将小鼠骨髓细胞培养为 DC; （2）构建 pUCmT/TLR4 和 pUCmT/actin 重组质粒, 建立检测小鼠 TLR4 mRNA 水
2、平的实时定量 PCR 实验; （3）用实时定量 PCR技术对体外培养 4、 6、 8、 10、 12 d 的 DC TLR4 mRNA 表达水平进行动态观察; （4）在 DC 培养体系中加入 DEX, 与常规培养DC TLR4 mRNA 表达水平进行比较。结果: （1）从小鼠骨髓细胞中成功诱导培养了 DC, 经免疫磁珠纯化后其纯度可达 90%以上; （2）建立了能精确分析小鼠 TLR4 mRNA 表达水平的 SYBR Green实时定量 PCR 实验; （3 ）在 DC 培养前期 TLR4 mRNA表达水平变化不大, 后期则明显升高; （4）DEX 可使 DC TLR4 mRNA 表达增强。结
3、论: 小鼠骨髓源 DC TLR4 mRNA 表达水平与其发育成熟阶段密切相关; DEX 促进 DC TLR4 mRNA 表达。 2【关键词】 实时定量 PCR 树突状细胞 TLR4 地塞米松Abstract AIM: To establish a SYBR Green quantitative realtime PCR method for detecting the expression of the TLR4 mRNA of mice and to monitor the dynamics for TLR4 mRNA level of mice bone marrowderived den
4、dritic cells (DC) in the process of the maturation and the effect of dexamethasone (DEX) on TLR4 expression. METHODS: (1) DC from mice bone marrow were induced by cytokines and separated by magnetic beads. (2) The combined plasmid pUCmT/TLR4 and pUCmT/actin for the standard materials in the realtime
5、 PCR was reconstructed. (3) The dynamics for the express TLR4 mRNA of DC cultivated in vitro for 4, 6, 8, 10, 12 days was detected respectively. (4) The TLR4 mRNA expression between DC treated with or without DEX was detected and compared. RESULTS: (1) The DC with the purity over 90% were fully sepa
6、rated in success. (2) A SYBR Greenquantitative realtime PCR method for analyzing the TLR4 mRNA expression level of the mice was successful established. (3) TLR4 mRNA level was stable early during the culture of DC and then rise obviously at last. CONCLUSION: There exists a 3close relationship betwee
7、n the level of TLR4 mRNA and the period of maturation of DC and the expression of TLR4 could be increased by DEX.Keywordsrealtime PCR; dendritic cells; toll like receptor4; dexamethasoneToll 样受体（toll like receptors, TLR）是一类重要的模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR）, 现已确认的人类TLR 家族成员有 11 个（ TLR1TLR1
8、1）, 其中发现最早和功能相对比较清楚的是 TLR4。TLR4 主要存在于巨噬细胞、 中性粒细胞以及树突状细胞（dendritic cells, DC）表面, 可接受 G-菌脂多糖（LPS）的刺激而活化, 进而通过一系胞内信号转导过程, 最终使转录因子 NFB 活化, 启动多种与炎症反应相关的基因转录。近年, 对于 TLR4 与 DC 发育成熟的关系以及 TLR4 介导的信号转导通路的研究逐渐受到关注, 人们意识到 DC 的功能状态很可能与 TLR4 所介导的信号转导有密切联系, 机体由于多种原因使 TLR4 表达下降或者上升, 其结果均可影响 DC 的成熟状态, 从而影响机体的免疫状况 1。
9、地塞米松（dexamethasone, DEX）目前已证实该药能够在免疫应答的各个环节发挥抑制效应, 其中包括抑制 DC 的抗原提呈能力和DC 的分化2。DEX 能否通过阻断 TLR4 信号转导途径来影响 DC的成熟,从而影响抗原的提呈？ 目前还没有定论。SYBR Green 4realtime PCR 是 PCR 定量技术中的一种, 可以对基因扩增的起始模板的拷贝数进行精确定量, 还可以通过熔解曲线判断扩增产物的特异性, 是一种灵敏度高、 特异性好的检测技术。我们应用 SYBR Green realtime PCR 技术, 建立了检测小鼠 TLR4 mRNA 表达水平的实时定量 PCR 实验
10、, 进而观察了在 DC 的发育成熟过程中TLR4 mRNA 表达水平的动态变化, 以及 DEX 对 DC TLR4 mRNA表达的影响。1 材料和方法1.1 材料 C57BL/6 小鼠（6 8 周龄, 雌性, 体质量 1820 g）, 购自北京军事医学科学院动物中心。SYBR Green I 荧光定量试剂盒购自北京东胜创新实验技术公司。实时定量采用美国Biorad 公司 Chromo 4TMRealtime PCR 仪, 配有该公司（原MJ 公司）Opticon Monitor 3 荧光定量分析软件。细胞因子rmGMCSF 及 rmIL4 为美国 Peprotech 公司产品。CD11C+ 细
11、胞磁珠分离纯化试剂盒为德国 Milentyi 公司产品。MMLV 反转录试剂盒、 PCR 试剂盒、 胶回收试剂盒、 pUCmT 载体连接试剂盒均购自上海生物工程技术服务公司。大肠杆菌 DH5 感受态细胞购自北京博大泰克生物基因技术公司。质粒抽提试剂盒购自北京Tigen 公司。DEX 为天津药业焦作有限公司生产。PCR 引物合成和质粒测序由上海生物工程技术服务公司完成。51.2 方法1.2.1 小鼠骨髓源 DC 的培养及纯化 （1）小鼠骨髓源 DC的培养: 采用细胞因子 GMCSF 和 IL4 联合诱导小鼠骨髓细胞向DC 定向分化, 方法简述如下: 收集 C57BL/6 小鼠股骨骨髓细胞, Tr
12、isNH4Cl 缓冲液裂解红细胞, RPMI1640 液洗涤 2 次后重悬细胞, 调整其密度为 1109/L,置于 6 孔培养板内, 37、 50 mL/L CO2、 饱和湿度下贴壁 3 h。吸弃上清液, 用 37 预温的RPMI1640 液轻轻洗去非贴壁细胞 , 每孔加入含 100 mL/L 胎牛血清、 10 g/L rmGMCSF、 2 g/L rmIL4 的 RPMI1640 完全培养液 2 mL 继续培养 , 隔日半量换液, 培养结束后通过反复吹吸收集疏松黏附细胞及悬浮细胞。 （2）DC 的纯化与鉴定: 应用德国Milentyi 公司生产的 CD11C+细胞磁珠分离试剂盒, 按试剂说明
13、书操作, 对培养 DC 进行纯化。采用 PE 标记的仓鼠抗小鼠 CD11c mAb, 通过流式细胞术（FCM）分析纯化前后的 DC 纯度。1.2.2 重组质粒 pUCmT/TLR4 和 pUCmT/actin 的构建 应用 RTPCR 技术分别从小鼠 DC 和脾细胞中获得 TLR4 和actin 基因片段, 与 pUCmT 载体连接,构建重组质粒pUCmT/TLR4 和 pUCmT/actin, 作为 realtime PCR 实验的定量模板。 （1）TLR4 和 actin 基因片段的制备: 每 5106 个6DC（或脾细胞）中加入 1 mL TRIzol 裂解细胞, 氯仿 异丙醇法常规提取
14、总 RNA, 通过紫外分光光度计测量 A260/280 的比值, 确定RNA 的纯度和浓度。采用 MMLV 反转录试剂盒合成 cDNA, 以cDNA 为模板进行 PCR 反应。TLR4 引物、 扩增条件及扩增片段长度如下: 上游引物: 5GCT TTC ACC TCT GCC TTC AC, 下游引物: 5CGA GGC TTT TCC ATC CAA TA; 扩增条件: 94变性 30 s, 60退火 30 s, 72延伸 30 s, 共 30 个循环; 扩增片段为 359 bp。actin 引物、 扩增条件及扩增片段长度为 : 上游引物: 5TGG AAT CCT GTG GCA TCC
15、A, 下游引物: 5TAA CAG TCC GCC TAG AAG CA; 扩增条件: 94变性 30 s, 62 退火 30 s, 72延伸 30 s; 共 30 个循环; 扩增片段为 334 bp。通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行鉴定, 然后在紫外灯下切下目的基因条带, 用胶回收试剂盒对 PCR 产物进行纯化回收, 即获得纯化的 TLR4 和actin 基因片段。 （2）重组质粒的连接、 转化、 阳性克隆筛选及鉴定: 将 pUCmT 载体分别与 TLR4 和 actin 基因片段以适当比例（摩尔比 13110）进行连接, 连接反应时间为 4 h。连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细
16、胞, 采用蓝白斑初次筛选和菌落PCR 再次筛选的方法确定阳性菌落, 在氨苄青霉素抗性 LB 培养液中扩增阳性菌落, 然后从菌液中提取质粒进行测序鉴定。1.2.3 SYBR Green I realtime PCR 检测方法的建立 （1 ）标准曲线绘制: 分别提取重组质粒 pUCmT/TLR4 和7pUCmT/actin, 通过紫外分光光度计测量质粒的 A260 值, 根据 Mr 和阿佛加德罗常数计算出分子拷贝数, 将重组质粒（即realtime PCR 反应的标准品）稀释成 1010、 109、 108、 107、 106、 105、 104 拷贝/mL。Realtime PCR 反应的总体系为 20 L, 其中包括上、 下游引物各 1 L（引物序列同前）, 重组质粒模板 4 L,
