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1、1HLAA*0201/Kb 及 MAGE3基因共转染 B16细胞的制备及其在 MAGE3肿瘤疫苗评价中的作用【摘要】 目的: 为了用 HLAA2.1 转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果, 制备共表达 HLAA*0201/Kb 嵌合基因和MAGE3 的 B16 黑色素瘤细胞。方法: 采用基因共转染的方法, 将HLAA*0201/Kb 和 MAGE3 转染到 B16 黑色素瘤细胞（B16HLAMAGE3 ）, 利用 RTPCR、 流式细胞术（FCM）和 Western blot 检测了 HLAA*0201/Kb 和 MAGE3 在 B16 黑色素瘤中的表达; 通过测定 CTL 活性和体内
2、抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE3 可以在 B16HLAMAGE3 中得到有效加工处理和提呈。结果: RTPCR、 FCM 和 Western blot 检测到 HLAA*0201/Kb和 MAGE3 在 B16HLAMAGE3 黑色素瘤中的表达 ; LDH 的方法观察到 MAGE3 疫苗免疫小鼠脾细胞对 B16HLAMAGE3细胞的特异性 CTL 反应, 抑瘤实验也证实, B16HLAMAGE3 细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论: MAGE3 基因在B16HLAMAGE3 黑色素瘤细胞中得到表达, 并被有效的加工处理、 提呈给特异性 CD8+T 细胞; B16HLAMAGE3 细胞可以用
3、来制备荷瘤模型, 且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。 【关键词】 HLAA2.1 转基因鼠 疫苗评价 肿瘤动物模型 基因2共转染 MAGE3 pIRES随着对肿瘤主动免疫疗法研究的不断深入, 人们逐渐认识到CTL 反应在肿瘤免疫中发挥着重要作用, 肿瘤抗原 CTL 表位的研究受到广泛关注, 许多重要的肿瘤抗原如黑色素肿瘤基因（MAGE）家族、 甲胎蛋白（AFP）及 erbB2 的 CTL 表位已被鉴定和识别1-3。该工作使肿瘤疫苗的研究尤其是肿瘤表位疫苗的研究得到了迅速的发展。另外, 对肿瘤疫苗的有效评价是肿瘤疫苗研究的一个重要方面。目前, 对人用肿瘤疫苗评价的研究应得益于
4、HLA 转基因小鼠的使用4, HLAA2 转基因小鼠是评价 HLAA2 限制的表位疫苗的有利工具。但是, 由于缺少表达 HLA/H2Kb 及人类肿瘤抗原的动物肿瘤细胞株, 对肿瘤疫苗的评价只能通过诱导 CTL 反应的手段即通过体外实验来进行。而对一种肿瘤疫苗的评价, 仅凭体外实验的结果是不够的, 如对疫苗抑瘤作用机制、 疫苗对肿瘤微环境的影响等方面的评价, 必须通过体内或宿主水平的实验来进行。因此, 为了补充 HLAA2 转基因小鼠在肿瘤疫苗评价中的作用, 本实验建立了一种既表达 HLA/H2Kb 嵌合基因, 又表达人的肿瘤抗原MAGE3 的小鼠肿瘤细胞株 B16HLAMAGE3, 并对该细胞
5、株的特点及功能进行了鉴定。1 材料和方法31.1 材料 pcDNAMAGE3 和 pET32aMAGE3 重组表达载体由本室构建; 小鼠黑色素瘤 B16 细胞株由本室保存 ; RNA 提取试剂 RNAex regent 及 DNA 纯化试剂盒购自上海华舜公司 ; 逆转录试剂盒、 PCR 反应混合物、 限制性内切酶 Nco I、 Xho I, T4连接酶、 DNA 及 Mr 标准品均为 TaKaRa 公司产品。质粒抽提为Vgene 产品; 真核表达载体 pIRES 及受体菌 TOPO10 由本教研室保存。异丙基硫代 D 半乳糖苷（IPTG ）为 Solarbio 产品。细胞转染试剂 （LIPOF
6、ECTAMINE）为 Introvigen 公司产品; 多肽MAGE3（271279 ） FLWGPRALV 由上海波泰生物科技有限公司合成。LDH 检测试剂盒购自德国 Roche 公司; rIL2 购自晶美生物技术公司; MAGE3 融合蛋白由本室纯化。HLAA*0201 转基因鼠（含有 HLAA*0201 的 1 和 2 结构域和 H2Kb 的 3 及胞内区结构域）由上海第二军医大学遗传教研室馈赠（许可证号: SCXKHU20020006） 。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 HLAA*0201/ Kb 嵌合基因和 MAGE3 的扩增 取HLAA*0201
7、转基因鼠脾脏, 常规抽提总 RNA 并反转录, 用 P1 和P2 引物扩增 HLAA*0201/Kb 嵌合基因。P1: 5CCGCTCGAGATGGCCGTCATGGCGCCCCG3(引入 Xho I 酶4切位点), P2: 5CGACGCGTCTGTCTTCACGCTAGAGAATG3（引入 Mlu I 酶切位点）; 根据 GenBank 人 MAGE3 基因序列（U03735）设计P3 和 P4 引物: P3: 5ggaattcaagcctcttgagcagaggagtcag3（引入 EcoR I 酶切位点）, P4: 5acgcgtcgacgtcaatggtgatggtgatgatgac
8、tcttccccctctctcaaaacc3（引入 Sal I 酶切位点） 。以 pcDNAMAGE3 为模板, 用 P3和 P4 引物扩增 MAGE3 基因; PCR 产物经 12 g/L 琼脂糖电泳进行鉴定、 DNA 胶回收试剂盒回收纯化。1.2.2 pIRESHLAMAGE3 真核表达载体构建 将经胶回收的 HLAA*0201/Kb 嵌合基因产物和 pIRES 空质粒分别用 Xho I和 Mlu I 双酶切, T4 连接酶连接, 即将 HLAA*0201/Kb 嵌合基因克隆到载体 pIRES 的多克隆位点 A, 酶切鉴定正确后, 抽提重组载体pIRESHLA/Kb 质粒 , 用 EcoR
9、 I 和 Sal I 双酶切割, 同时用该酶处理胶回收的 MAGE3 的 PCR 产物, T4 连接酶连接 , 得到重组表达载体 pIRESHLAMAGE3。1.2.3 HLAA*0201/Kb 嵌合基因和 MAGE3 共转染 B16肿瘤细胞 复苏小鼠黑色素瘤 B16 细胞, 常规培养至对数生长期 , 将细胞转移到 24 孔板, 待细胞密度到 90%, 按说明书用5LIPOfectin2000 脂质体转染试剂将重组质粒pIRESHLAMAGE3 和空质粒 pIRES 分别转染 B16 细胞, 24 h后用终浓度为 1000 mg/ L 的 G418 筛选 , 4 周后经 RTPCR、 细胞流式
10、术（FCM）及 Western blot 鉴定 HLAA*0201/Kb 和MAGE3 的表达。1.2.4 动物免疫 动物免疫采用 DNA 疫苗初免蛋白苗加强的策略。将 HLA 转基因小鼠分为 2 组, 每组 16 只。给实验组小鼠后退肌肉注射用 PBS 稀释的 pcDNAMEGE3 质粒（100 g/只）, 对照组注射相同体积的 PBS; 3 周后, 重复 1 次。第 2 次注射后 3 周, 于小鼠颈部皮下注射经不完全福氏佐剂乳化的 MAGE3 融合蛋白（50 g/只） 。1.2.5 LDH 释放法测定 CTL 活性 按参考文献5方法, 最后1 次免疫后的第 10 天, 处死小鼠（4 只/组
11、）无菌取脾脏, 分离单个核细胞, 调整细胞密度为 2107/L。将细胞转移到 24 孔板, 0.5 mL/孔。然后将细胞分为 3 组: （1 ）加入终浓度为 50 mg/L 的MAGE3 融合蛋白; （2）加入终浓度为 50 mg/L 的MAGE3271279 短肽; （3 ）加入 PBS 做为阴性对照。最后加入终浓度 20 U 的 rIL2, 37培养 7 d 作为效应细胞。在培养的第 3 天和第 5 天半量换液 1 次。培养时间结束后, PBS 洗涤细胞, 调整细胞密度为 1107/L, 将效应细胞加入圆底 96 孔板, 同时加入不同6靶细胞。靶细胞为分别用 MAGE3 和 MAGE327
12、1279 肽刺激的 T2 细胞, pIRESHLAMAGE3 和 pIRES 转染的 B16 细胞, 共4 种。使效应细胞和靶细胞的比例为 1001 和 501。然后按照LDH 试剂盒说明书进行 CTL 活性测定。1.2.6 抑瘤实验 在最后 1 次免疫后的第 7 天, 将pIRESHLAMAGE3 和 pIRES 转染的 B16 细胞（106/只）分别移植给免疫小鼠（6 只 /组）, 然后每天观察肿瘤生长情况。用游标卡尺测量肿瘤直径, 按公式（长径短径 2）/2 计算肿瘤块的体积（mm3） 。1.2.7 统计学处理 均采用 Students t test。2 结果2.1 pIRESHLAMA
13、GE3 共表达载体的鉴定 pIRES 具有2 个多克隆位点 A 和 B, 用 PCR 的方法将 HLA/Kb 嵌合基因克隆到多克隆位点 A, 将 MAGE3 克隆到多克隆位点 B。酶切方法进行鉴定（图 1） 。经测序 2 个插入基因片段完全正确。图 1 pIRESHLAMAGE3 共表达载体的酶切鉴定（略）7Fig 1 Identification of recombinant of pIRESHLAMAGE3 by restriction endonuclease1: pIRESHLA and MAGE3 (from top), digested by EcoR I and Sal I; M
14、: DNA marker; 2: pIRESMAGE3 and HLA/Kb (from top), digested by Xho I and Mlu I.2.2 pIRESHLAMAGE3 共转染 B16 细胞的鉴定 用脂质体方法将重组表达载体 pIRESHLAMAGE3 和空载体 pIRES 分别转染 B16 细胞, 经 G418 筛选 4 周, 采用常规 RTPCR 的方法观察到转染细胞的 HLA/Kb 和 MAGE3 的 mRNA 表达; 采用流式细胞的方法, 用 FITC 标记的抗 HLAA2 的抗体检测到 HLA 的表达; 为了便于 Western blot 鉴定 MAGE3 的
15、表达 , 克隆 MAGE3 时, 在下游引物中引入了 His 标签, 用抗 His 抗体经 Western blot 测定了 MAGE3 的蛋白表达（图 2） 。图 2 HLA/Kb 和 MAGE3 在共转染 B16HLAMAGE3细胞株中的表达（略）Fig 2 Expression of HLA/Kb and MAGE3 in B16HLAMAGE3 melanoma cells8A: Detection HLA/Kb and MAGE3 mRNA by RTPCR; B: Identification of MAGE3 protein expression by western blot with the antibody of antiHistag; C: Detection of HLAA*0201/H2kb protein in B16HLAMAGE3 melanoma cells by FCM analysis. (Closed histogram, B16HLAMAGE3 cells, Open line histogram, wild B16 cells). 1, 2: HLA/Kb and MAGE3 mRNA expression in wild B16 cells; 3,
