双水相萃取α淀粉酶PPT课件.ppt

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1、实验前预备工作 请各位同学按照学号顺序就做 每排坐四 位同学 为一个小组 请各小组同学将各自桌面上的所有玻璃仪 器清洗干净 放入烘箱烘干备用 1 双水相萃取 淀粉酶及其影响因素分析 生物分离工程 综合平台实验 2 实验背景介绍 3 双水相萃取 概念 利用溶质在两个互不相溶的亲水相之间的 分配系数不同而进行分离的萃取技术 问题 双水相成相机理及条件 影响蛋白质在双水相中分配的因素 双水相的优势 4 1 双水相的类型与形成原因 双水相类型 类类型常用 高聚合物 高聚物 非离子型高聚物 非离子型高聚物 PEG Dex 聚丙烯烯二醇 Dex 离子型高聚物 非离子型高聚物羧羧甲基纤维纤维 素钠钠 Dex

2、 离子型高聚物 离子型高聚物 羧羧甲基纤维纤维 素钠钠 羧羧甲 基葡聚糖钠钠 高聚物 盐盐非离子型高聚物 无机盐盐PEG 磷酸盐盐 硫酸盐盐 PEG 聚乙二醇 Dex 葡聚糖 5 1 双水相的类型与形成原因 双水相形成原因 聚合物 聚合物 聚合物的不相溶性 当两种高 分子聚合物之间存在斥力作用时 由于相对分子质量较大 分子 之间的相互排斥作用于混合过程 中熵的增加相比占主导地位 一 种聚合物分子的周围将聚集同种 分子而排斥其他分子 当达到平 衡时 形成分别富含不同聚合物 的两相 聚合物 盐 盐析作用 2 2 葡聚糖水溶液与等 体积的0 72 甲基纤维素 钠水溶液混合静置 6 常用的双水相 PE

3、G DEX 平衡后 上相富含PEG 下相富含Dex PEG 无机盐 平衡后 上相富含PEG 下相富含无机盐 7 相图的组成及意义 双节线 曲线TKB 上方为双水 相 下方为均一相 系线 直线TMB 系线上各点处系统总浓度不同 但均分 成组成相同 T B 而体积不同的两相 两相体积近似服从杠杆原则 即 VT VB BM MT K点 系线的长度是衡量两相之间差 别的尺度 系线越长 两相间差别 越大 反之则越小 在K点系线长度 趋向为零 两相差别消失 任何溶 质在两相间的分配系数均为1 此点 称为临界点 双水相 均一相 8 影响双水相分配理论 2 1 成相聚合物的相对分子质量 2 2 成相聚合物的浓

4、度 2 3 盐的种类和浓度 2 4 pH的影响 2 5 温度的影响 9 双水相的优势 含水量高 萃取条件温和 不会引起生物 活性物质变性 没有有机溶剂残留 去细胞碎片的同时纯化蛋白 使分离过程 更加经济 容易实现反萃取 10 11 实验安排 星期六上午 8 00 11 40 实验分组 试剂配 置 实验一 星期六下午 2 00 5 30 实验二与实验三 星期日上午 8 00 11 30 实验四与实验五 星期日下午 2 00 5 30 实验二三四五的结 果分析与讨论 完成实验报告 整理教室卫生 12 实验一 PEG NH4 2SO4双水相 相图的制作 13 一 实验目的 掌握浊点法制作双水相相图

5、双节线 的方法 分析比较PEG分子量对双水相成相的影响 14 二 实验原理 因层析作用 一定浓度的 PEG与 NH4 2SO4混合溶液可 形成双水相 相图即用于描述双 水相的成相条件及定量关系 双节线是双水相与均一相的 分界线 可用浊点法测定制作双 水相图中的双节线 双水相 均一相 15 二 实验材料 1 PEG 400 800 2000 见公共实验台 2 43 的 NH4 SO4溶液 称取43g硫酸铵 见公 共实验台 溶解于适量水中 定容至100mL 称重 计算密度 3 蒸馏水 值日生从117打水 放在桶中备用 4 碱式滴定管 5 试管 干燥无水 16 三 实验步骤 PEG 800与2000

6、为固体 可于60 加热熔化后称取 17 三 实验步骤 次数 H2O加量 g NH4 2SO4溶液 加量 纯 NH4 2SO4 累计量 g 溶液累 计 总量 g PEG NH4 2SO4 mL g 10 5 20 3 0 5 30 3 0 5 40 3 0 5 50 3 0 5 60 5 红笔标记的体积可机动 18 四 实验注意事项 使用干燥洁净的试管 称取PEG时 要滴加在试管底部 避免 挂到试管壁上 滴定和加水过程 避免液体溅到试管壁 上 初始几次滴定过程 必须要缓慢逐滴滴 加 NH4 2SO4溶液 若滴下 NH4 2SO4后 溶液出现浑浊 但振荡后又恢复澄清 说明已接近浊点 之后要缓慢逐滴

7、滴加 NH4 2SO4溶液 19 五 实验结果与分析 次数 H2O加量 g NH4 2SO4溶液 加量 纯 NH4 2SO4 累计量 g 溶液累 计 总量 g PEG NH4 2SO4 mL g 10 5 20 3 30 3 40 3 50 5 60 5 NH4 2SO4溶液累计加量V盐 ml 滴定后读数 初始读 数 NH4 2SO4溶液累计加量m盐 g V盐 纯 NH4 2SO4累计量m g 43 V盐 溶液累计总量m总 g mPEG m盐 m水 PEG400 mPEG m总 NH4 2SO4 m m总 20 五 实验结果与分析 不同分子量PEG的相图 如左图所示 由图可知 随PEG分子量的

8、增大 双 节线对称性 临 界点 原点 表 明其系统分相动力 21 六 思考题 为什么随PEG分子量增大 双水相系统分相动力 增强 22 实验分组安排 每四个人一大组 每两个人一小组 分别完成两 种PEG的相图制作 交叉验证 实验完成后 及时清洗玻璃仪器 置于烘箱烘干 备用 完成下午试剂的配置工作 23 实验二 三 PEG分子量 PEG浓度 对 淀粉酶在双水相中分配的影响 24 一 实验目的 掌握PEG浓度 分子量对 淀粉酶分配行为影响 的研究方法 分析比较PEG分子量 PEG浓度对 淀粉酶分配 行为的影响 25 二 实验原理 PEG的分子量对 淀粉酶的分配具有重要影响 随 PEG分子量的增大

9、双水相分相动力增强 两相间差异 增大 选择性增强 但PEG的疏水性增强 不利于蛋白 向上相的分配 26 二 实验原理 在PEG分子量一定的条件下 PEG浓度以及硫 酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差 异 从而影响 淀粉酶在两相间的分配 27 三 实验材料 PEG分子量的影响 1 0 02 mol L PB 7 0 的配置 取 6 1ml 0 2M的Na2HPO4溶液加3 9 mL0 2M 的NaH2PO4混匀 用时稀释至2000 mL 全班一起配置 每组分取400mL 于三角烧瓶 2 1 的 淀粉酶酶液 称取2g 淀粉酶溶解于200mL 0 02 mol L pH 7 0的 磷酸缓冲液

10、中 全班一起配置 过滤后于4摄氏度备用 3 PEG 800 称取65 g PEG800 于60摄氏度水浴加热熔化备用 4 PEG 2000 称取25 g PEG 2000 于60摄氏度水浴加热熔化备用 全班一 起配置 5 40 的硫酸铵溶液 称取80 g硫酸铵 加适量pB 7 0 溶解 定重至200g 6 带刻度的玻璃离心管4 根 小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 28 四 实验步骤 PEG分子量的影响 PEG 400 为液体 直接添加1 6g 条件 PEG 16 硫酸铵 20 pH7 0 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固体充分溶解 29 四 实验步骤 PE

11、G 分子量 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 400 800 2000 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 30 二 实验材料 PEG浓度 1 PEG 800溶液 同前 2 0 02 mol L PB 7 0的配置 同前 3 1 的 淀粉酶酶液 同前 4 40 的硫酸铵溶液 同前 5 带刻度的玻璃离心管4 根 小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 31 三 实验步骤 PEG浓度的影响 总

12、重量为10g 硫酸铵浓度固定为20 PEG分子量选择800 称取的PEG800 对应的PEG浓度分别为多少 32 四 实验步骤 PEG 浓度 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 33 五 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固 体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相 将多余上相和少量 下相弃去 换吸管 吸

13、出下相 每个样品组均需设置空白对照 用于调零 34 六 实验数据处理分析 分子量 D 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 400 800 2000 R VT VB VT为上相体积 VB为下相体积 K CT CB CT为上相浓度 CB为下相浓度 35 六 实验数据处理分析 1 分析分配系数是大于1还是小于1 以确定蛋白 的分配选择性 2 分析分配系数随PEG分子量的增大 其趋势是趋 向等于1还是趋向远离1 显示两相性质差异以 及蛋白分配差异 3 分析回收率 确定蛋白质在选择性分配某相时 在该相的回收效率 36 六 实验数据处理分析 案例 37 六 实验数据处理分析 案例 38 实验三 五

14、 硫酸铵浓度 pH值 对 淀粉酶在双水相中分配的影响 39 一 实验目的 硫酸铵浓度 pH值对 淀粉酶分配行为影响的研 究方法 分析比较硫酸铵浓度 pH值对 淀粉酶分配行为 的影响 40 二 实验原理 在PEG分子量一定的条件下 PEG浓度以及硫 酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差 异 从而影响 淀粉酶在两相间的分配 pH值会影响蛋白质及溶液的解离状态 从而 影响蛋白质在两相中的分配 41 二 实验材料 硫酸铵浓度 1 PEG 800溶液 同前 2 0 02 mol L PB 7 0的配置 同前 3 1 的 淀粉酶酶液 同前 4 40 的硫酸铵溶液 同前 5 带刻度的玻璃离心管4 根

15、小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 42 三 实验步骤 硫酸铵浓度的影响 对应的硫酸铵浓度分别为多少 固定条件 PEG 800 PEG浓度20 pH值7 0 43 三 实验步骤 硫酸铵 浓度 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 44 二 实验材料 pH值 1 0 02 mol L pH6 4的磷酸缓冲液的配置 取2 65 mL 0 2M的Na2HPO4

16、溶液加7 35 mL0 2M的NaH2PO4混 匀 稀释至100mL 每组分25mL 2 0 02 mol L pH5 8 的磷酸缓冲液的配置 取0 8ml 0 2M的Na2HPO4溶液加9 2mL0 2M的NaH2PO4混匀 稀释至100mL 3 0 02 mol L pH8 0的磷酸缓冲液的配置 取 9 47 ml 0 2M的Na2HPO4溶液加 0 53 mL0 2M的NaH2PO4混 匀 稀释至100mL 每组分25mL 45 三 实验步骤 pH值的影响 固定条件 PEG 800 PEG浓度16 硫酸铵浓度20 46 四 实验数据处理 PH值 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 5 8 6 4 7 0 8 0 R VT VB VT为上相体积 VB为下相体积 K CT CB CT为上相浓度 CB为下相浓度 47 四 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固 体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相 将多余上相和少量 下相弃去 换吸管 吸出下相 每个样品组均需设置空白对照 用于调零 48 六 实验数据处理分析 1