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1、1MAPK 途径磷酸化在胰岛素样生长因子1 促进人骨髓瘤细胞株 KM3 增殖中的作用作者：王华芳，胡豫，孙春艳，王雅丹【摘要 】 本研究探讨胰岛素样生长因子1 （IGF1 ）对人骨髓瘤细胞株 KM3 增殖的影响以及 MAPK 途径磷酸化在该过程中的作用。采用流式细胞术检测不同浓度的重组人 IGF1 处理后 KM3 细胞周期的变化，Western blot 法检测细胞内 MAPK 信号转导途径主要分子 Erk1/2 磷酸化在 IGF1 刺激及 PD98059 特异性抑制作用下的改变， TUNEL 法检测特异性阻断 Erk1/2 磷酸化在抑制KM3 细胞增殖和诱导凋亡中的作用。 结果表明， IGF
2、1 可以显著提高 S 期和 G2/M 期的 KM3 细胞比率和细胞内 Erk1/2 分子的磷酸化水平，阻断 IGF1 引起的 Erk1/2 磷酸化可以显著抑制 KM3 细胞的增殖并引起其凋亡。结论： IGF1 引起的 Erk1/2 分子磷酸化在KM3 细胞增殖过程中起着十分重要的作用。 【关键词】 骨髓瘤Effect of MAPK Signaling Pathway Phosphorylation on Proliferation of Myeloma Cell Line KM3 by Insulinlike 2Growth Factor 1Abstract In order to stud
3、y the effect of insulinlike growth factor 1 (IGF1) on proliferation of myeloma cell line KM3 and the role of MAPK pathway phosphorylation in this process, the cell cycle distribution shift of KM3 after incubation with series concentration of IGF1 was detected by flow cytometry. PhosphorateErk1/2, th
4、e key molecule of MAPK pathway, was examined by Western blot after KM3 cells being pretreated with or without PD98059, the special inhibitor of Erk1 and Erk2 phosphorylation. The effect of specifically blocking Erk1 and Erk2 phosphorylation on proliferation and apoptosis of KM3 cells were detected w
5、ith TUNEL staining. The results showed that the KM3 cells at S and G2/M phase increased and the phosphorylation of Erk1 and Erk2 became intensive when incubated with different concentration of IGF1. PD98059 could decrease the phosphorylation of Erk1/2 induced by IGF1 and induce the apoptosis of KM3
6、cells. It is concluded The phosphorylation of MAPK signaling pathway trigged by IGF1 plays an important role in the proliferation of myeloma cell line KM3.3Key words IGF1；MAPK pathway；Erk 1/2 phosphorylation; multiple myeloma多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）在恶性血液系统疾病中发病率居第二位，其发病机制尚不清楚。胰岛素样生长因子1（insulinli
7、ke growth factor I , IGF1）与多发性骨髓瘤细胞的增殖密切相关，它不仅刺激多发性骨髓瘤细胞的分裂，增殖和转移，还具有抑制地塞米松诱导的细胞凋亡、刺激肿瘤自身分泌血管内皮生长因子等多种作用1-5 。本研究探讨与多发性骨髓瘤细胞增殖关系密切的丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）信号途径在 IGF1 促进 MM 细胞增殖中的作用。材料和方法细胞培养人多发性骨髓瘤细胞株 KM3 由上海第二军医大学侯健教授惠赠，用含 10% 小牛血清、100 U/ml 青霉素、100 g/L 链霉素的DMEM，在 37、 5 % CO2、
8、饱和湿度条件下培养。试剂与实验分组4重组人 IGF1 从 Gibco 公司购得，分别用无血清细胞培养液稀释成不同浓度的母液保存；抗人 Erk1/2 磷酸化抗体购自 Santa Cruz 公司；酪氨酸蛋白磷酸化酶抑制剂 PD98059 购自 Sigma 公司。细胞周期检测2104/ml 对数生长期细胞接种于 6 孔培养板中。37 、5% CO2、饱和湿度条件下培养 24 小时后，换用无血清培养液培养 24小时，再加入 10、20、40 和 100 ng/ml 4 个不同浓度的 IGF1，每种浓度重复 3 孔，并设阴性对照，继续培养 48 小时后收获细胞，用 PBS 洗涤 2 次，用 75%冷乙醇
9、重悬，4保存固定过夜。用 PBS再次洗涤 2 遍后，用 2 ml PBS 重悬，加 10 mg/ml 的 RNA 酶 A 200 l 后于 37水浴 30 分钟，加 100 g/ml 的碘化丙啶 400 l混匀，4避光反应 2 小时后进行流式细胞仪分析（ FACS） ，检测波长 488 nm。Erk1/2 磷酸化检测对数生长期的 KM3 细胞约 5106/瓶，实验前 1 天换成无血清培养液培养，以减少血清中各种细胞因子对结果的影响。同细胞周5期检测方法，刺激 KM3 细胞 10 分钟后收获细胞，未加 IGF1 组作为空白对照，阴性对照组中分别加入 Erk1/2 磷酸化特异性阻断剂PD98059
10、 预处理细胞 24 小时，使其终浓度为 50 mol/L。收获细胞在加入裂解缓冲液（RIPA buffer）后，置冰上裂解 20 分钟， 4 500g 离心 10 分钟，取上清，用 Bradford 法测定蛋白浓度。每组取 40 g 蛋白，与 Laemmli 样品缓冲液混合后，煮沸 5 分钟后上样，以 12 SDS聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5% 脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗， 37 孵育 1小时，用含 0.5% Tween20 的 PBS（PBST）洗膜，加入二抗，室温孵育 1 小时，用 PBST 洗膜，DAB 显色。PD98059 诱导 KM3 细胞凋亡的 TUN
11、EL 法检测以 10、25、50 和 80 mol/L 4 组浓度 PD98059 预处理 KM3细胞 24 小时，再以 40 ng/ml 的 IGF1 作用 10 分钟后收获并固定细胞。TUNEL 细胞凋亡检测按照说明书进行。每个浓度组取 3 个独立的实验标本，每张切片随机计数 100 个细胞，根据 TUNEL 阳性细胞计算细胞凋亡率。统计方法检测数据以SD 表示，应用 SPSS 13.0 软件对结果进行统计学6分析。结 果IGF1 对细胞周期的影响KM3 细胞经 10、20、40 和 100 ng/ml IGF1 处理 48 小时后，对其细胞周期分析发现，随着 IGF1 浓度的增加，G0/
12、G1 期细胞的百分比降低，而 S 期和 G2/M 期细胞百分比逐渐增加；10 和 20 ng/ml 组与 40 ng/ml 和 100 ng/ml 组之间的差异具有显著性（p0.01） （图 1，附表） ，这提示经过 IGF1 作用后 KM3 细胞大量进入 S 期和 G2/M 期，增殖活跃。MAPK/Erk 磷酸化在 IGF1 处理后 KM3 细胞中的作用利用特异性磷酸化抗体和 Western blot 技术检测经过 IGF1 处理后的 KM3 细胞 Erk1/2 的磷酸化情况。结果表明，缺乏血清和IGF1 的培养液存在基础的 Erk1/2 的磷酸化，但是磷酸化强度较低，而经过不同浓度的 IG
13、F1 刺激后 Erk1/2 的磷酸化明显增强，并且与 IGF1 的终浓度呈正相关关系（图 2） 。加入终浓度为 50 mol/L 时 Erk1/2 磷酸化特异性阻断剂 PD98059 组均只能检测到十分微弱的 Erk1/2 的磷酸化（图 3） 。7凋亡检测TUNEL 检测到的阳性细胞呈典型的凋亡表现，细胞体积变小，细胞核固缩并被染成深蓝色，少量细胞表现为细胞核内多量蓝色和蓝黑色的粗大颗粒，阴性对照组细胞则未着色（图 4） 。检测结果表明，经不同浓度（10、25、50、80 mol/L） PD98059 处理 24小时后的 KM3 细胞均出现凋亡，4 组的平均凋亡率分别为13.8%、15.5%、
14、37.5%和 39.6%。讨 论胰岛素样生长因子（IGF）是一类氨基酸序列和功能与胰岛素相似的促细胞生长多肽，其中游离 IGF1 是主要的活性形式。IGF 在IGF 受体的介导和 IGF 结合蛋白的调节下，通过自分泌、旁分泌和内分泌的方式作用于靶器官，发挥较强的促细胞有丝分裂原作用，在胚胎发育、细胞正常生长发育、骨再建、神经生长以及在肿瘤细胞的增殖和分化，肿瘤免疫等方面起着重要作用。研究提示,IGF 的刺激与肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展、增殖、侵袭、转移和凋亡的关系密切7-10 。近年来的临床研究表明，骨髓瘤患者血清中 IGF1 浓度显著高于正常人，MM 骨髓组织中IGF1 呈高
15、表达，并且有研究表明，骨髓瘤患者预后与血清中的IGF1 浓度呈正相关关系11 。同时发现在骨髓瘤细胞表面亦大8量表达 IGF1 受体12 ，这些结果提示 IGF1 可以直接作用于多发性骨髓瘤细胞。本研究设计采用梯度浓度的 IGF1 刺激培养的骨髓瘤细胞系KM3，细胞周期检测的结果显示，KM3 细胞的 S 期和 G2/M 期细胞比例显著上升，而且该比例与培养液中 IGF1 浓度成正相关。此结果说明 IGF1 能够促进骨髓瘤 KM3 细胞增殖。在对 IGF1 促进骨髓瘤细胞增殖的机制研究中，与细胞增殖、分化、细胞周期调控和生存密切相关的 MAPK 信号通路引起研究者们的关注5，13，14 。MAP
16、K 信号通路由一组级联活化的丝 苏氨酸蛋白激酶组成，其作用底物主要是多种核蛋白和膜受体，包括转录因子, 蛋白激酶，磷脂酶和细胞骨架蛋白，目前以 Erk1 和 Erk2分子研究较为清楚，多种细胞因子，神经递质，膜去极化，钙内流等均通过 Erk1/2 信号转导途径传导。本研究通过检测 IGF1 刺激后 KM3 细胞内 Erk1/2 分子的磷酸化状态改变情况，发现 Erk1/2分子的磷酸化与 IGF1 浓度成正比，表现为 IGF1 浓度越高，Erk1/2 分子的磷酸化程度越强，且基础条件下可以检测到 KM3 细胞存在 Erk1/2 的磷酸化，这提示 Erk1/2 磷酸化是维持 KM3 细胞增殖的重要因素；结合细胞周期的研究结果，同时给予 IGF1 和Erk1/2 磷酸化阻断剂时 KM3 的细胞周期变化不明显，单纯给予Erk1/2 磷酸化阻断剂则可以显著
