《B超在测定不同方法消毒的骨形成蛋白成骨诱导活性中的意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《B超在测定不同方法消毒的骨形成蛋白成骨诱导活性中的意义（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1B 超在测定不同方法消毒的骨形成蛋白成骨诱导活性中的意义作者：赵廷宝范清宇张殿忠文艳华何一成 【关键词】 超声检查, 关键词: 骨形态，发生蛋白质类;骨生成;超声检查 摘 要: 目的 探讨 B 超在测定骨形成蛋白（bone morpho-genetic protein，BMP）成骨诱导活性的意义，为 BMP 成骨诱导活性的测定提供一种新方法. 方法 将自行提取的牛 BMP（bBMP）分别经环氧乙烷熏蒸消毒和 10000Gy-射线照射消毒后埋入小鼠右、左后腿肌袋内，于术后 3，5 ，7，14，21 和 28d 行 B 超、X 射线照相和组织形态学观察. 结果 B 超 3，5 和 7d 与对照组
2、相同，均为正常组织回声，14，21 和 28d 有软骨和骨组织回声，在此时间段内随时间延长回声增强.X 射线照相 3，5，7 和 14d 无骨组织影像，21，28d 有明显的新生骨征象.组织形态学观察 3，5，7d 有大量间充质细胞在 BMP 植入部位聚集，并诱导间充质细胞分化为成软骨细胞，14d 有新生软骨和新生骨组织形成，21，28d 可见大量的新生的成熟骨组织.环氧乙烷熏蒸和 10000Gy-射线照射消毒的bBMP 均有很强的成骨诱导活性. 结论 B 超、X 射线照相和组织形态学观察结果在时间上有很强的一致性，证明 B 超作为一种新的2BMP 成骨诱导活性的检测手段是切实可行的.-射线照
3、射消毒 BMP更方便、更安全. Keywords:bone morphogenetic proteins;osteogenesis;vl-trasonogrophy Abstract:AIM In order to investigate the significance of B-mode ultrasound for determination of bone induction activity of bone morphogenitic protein（BMP）and to search for a new method to determinate the activity.METH
4、ODS Self-pre-pared bovine bone morphogenetic protein（bBMP）sterilized by enthlene oxide and-ray with same weight was buried in the muscles of the behind right and left leg of the mouse re-spectively.The place which bBMP was buried in was exam-ined with B-mode ultrasound，X-ray and histologically at3，5
5、，7，14，21and28days after the operation respectively.RESULTS No new bone was found by B-mode ultrasound and X-ray at3，5，7，14days and the new bone was found at21，28days.A large number of mesenchymal cells were found histologically in the muscles in which bBMP was buried at3，5，7days.The new cartilage an
6、d the new bone was found at14day and the new bone which was like 3the normal bone was found at21，28days.It seems that there was no difference of the bone induction activity between bBMP steril-ized by enthlene oxide and-ray.CONCLUSIONS The de-terminative results of B-mode ultrasound，X-ray and histo-
7、logical section were identical with time.So it seems feasible that B-mode ultrasound is regarded as a new method to deter-mine the bone induction ability of bBMP.It is safer and more convenient for bBMP sterilized by-ray. 0 引言 国内已有多家单位掌握了骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的提取技术，这使 BMP 的广泛研究和应用成为可能
8、.但是 BMP 提取工序繁杂，生产条件限制颇多，所得到的 BMP 不是每批次都有成骨诱导活性，故供研究或应用前均须行生物学活性测定.目前常用的测定方法是 X 射线照相和组织形态学观察.我们根据 B 型超声的工作原理，试行将其引入到 BMP 成骨诱导活性的测定，得到了令人满意的结果，从而为 BMP 的研究和应用提供了一种新的活性测定方法，丰富了其检测手段. 1 材料和方法 41.1 材料 取健康雄性小鼠 24 只（第四军医大学动物中心提供） ，体质量 2530g. 1.2 方法 1.2.1 bBMP 的提取与消毒保存 按金岩等1 介绍的改良Urist 等2 方法，取新鲜牛四肢长骨的皮质骨，粉碎成
9、直径1mm 的骨颗粒，依次经 1 1 甲醇/ 氯仿、 0.6mol L-1 盐酸、2mol L-1 氯化钙、0.5mol L -1 乙二胺四乙酸二钠、8mol L-1 氯化锂、6mol L-1 尿素+0.5mol L-1 氯化钙+10mmol N-乙基马来酰亚胺透析、离心，4mol L-1 盐酸胍+0.05mol L-1 氯化钙、0.25mol L-1 柠檬酸缓冲液透析、离心等处理后，得到成骨诱导活性较高的粗提 bBMP，分别用环氧乙烷和 60 Co-射线 10000Gy 照射消毒，置-80冰箱保存备用. 1.2.2 bBMP 成骨诱导活性的测定 随机将小鼠分为实验组 18只和对照组 6 只.
10、实验组于每只小鼠（行戊巴比妥钠 10mL kg-1 ，ip 麻醉）两侧后腿股部埋入等量的（ 5mg）bBMP，右侧为环氧乙烷消毒者，左侧为 -射线消毒者. 对照组做空白对照 . 分别于术后 3，5，7，14，21 和 28d 行 B 超、X 射线照相和组织形态学观察.B 超 :致死量麻醉下（行戊巴比妥钠 50mL kg-1 ，ip，下同） ，将小鼠四肢伸展，仰卧位固定于泡沫板上，在 bBMP5植入部位行 B 超检查，随后取材.X 射线照相 :麻醉同上，俯卧位，四肢自然伸展摄 X 线片，随后取材.组织形态学观察:致死量麻醉后随即取材. 对照组: 致死量麻醉下，先行 B 超检查，再行 X 射线照相
11、并取材. 以上取材后的组织，经戊二醛固定 24 48h，盐酸脱钙 24h 后碳酸锂中和，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，HE 染色，光镜下观察. 2 结果 2.1 B 超 对照组均为正常组织回声.实验组 3，5 和 7d 的 B超回声与对照组相同.14d，在 bBMP 植入部位产生弱的回声，21和 28d 回声增强（Fig1）.在此时间段内，回声随时间延长而增强.经计算机图像分析，左右两侧的回声无差别. 2.2 X 射线照相 对照组均为正常组织影像，实验组 3，5，7和 14d 的 X 线表现与对照组相同，21 和 28d 出现新生骨组织影像（Fig2）. 在此时间段内，X 线片上的新生骨密度随
12、时间延长而逐渐增加. 经计算机图像分析，左右两侧的 X 线表现无差别. 2.3 组织形态学观察 对照组为正常的肌肉组织.实验组 3，5和 7d，bBMP 植入部位的肌肉内有大量的间充质细胞聚集，其中7d 时间充质细胞被诱导分化为软骨细胞（Fig3）.14d 有大量的新6生软骨及少 量的骨组织并可见骨小梁 .21 及 28d 新生骨组织明显增多，骨小梁丰富，有骨髓和骨髓腔形成并可见哈佛系统（Fig4）. 3 讨论 3.1 BMP 成骨诱导活性测定的必要性 对肿瘤性骨缺损进行修复是骨科临床一个不容回避的问题，为此范清宇等3，4 独创性的应用异体脱钙骨基质颗粒复合骨水泥进行了有益的尝试并获得了令人瞩
13、目的临床结果，该材料具有极好的可塑型性5 ，适宜于修复各个部位的骨缺损，复合 BMP 后可具有成骨诱导活性6，7 ，有很好的应用前景. 为进一步研究和开发应用，我们开展了提取 BMP 的工作，但是，BMP 提取工艺繁杂，生产条件限制多，最后所得到的 BMP 不一定都有成骨诱导活性，因此，在提取后供给研究或临床应用之前必须进行成骨诱导活性的测定.为保证所得到的 BMP 具有活性，在提取过程中应注意以下几个问题1 :用于提取 BMP 的新鲜骨质在获得后应及时对其处理，并马上用于 BMP 的提取，或保存于-40以下的冰箱内，否则将大大影响BMP 提取的产量和活性.虽然 BMP 可耐受较高的温度（55
14、75不致失活） ，但提取过程中长时间在 030温度下搁置，可使 BMP 因自溶而损耗.很好的冻干可以明显地保存BMP 的活性，并不受保存时间长短的影响，但反复冻溶以及在液态下保存可影响其活性.BMP 对一些外源性酶如胰蛋白酶和糜蛋白7酶敏感. 对碱敏感，pH 值超过 8.5 即可使其失去活性.机体组织中，特别是骨组织中含有一种 BMP 降解酶（BMP-ase ） ，对释放及扩散出来的 BMP 有降解作用，因此，在提取过程中要加入 BMP-ase 的抑制剂，即 N-乙基马来酰亚胺. 3.2 B 超测定 BMP 成骨诱导活性的可行性 成骨诱导活性鉴定多在骨骼以外的组织器官中进行，一般用异种动物.植
15、入的部位有小鼠的后肢股部肌肉陷窝、大鼠及兔的腹部肌肉和狗的颈部肌肉，另外还可以在细胞培养基中植入.常用的观察方法是 X 射线照相和组织形态学观察8，9 .B 超在骨科的应用已有报道10 ，我们根据其工作原理，将其应用于 BMP 成骨诱导活性的测定，拟作为新的观察方法，得到的结果与 X 射线照相、组织形态学所得的结果有很强的一致性，并有较好的分辨率，因此，它可作为 BMP 成骨诱导活性测定手段的有益补充. B 型超声的声束不能穿透致密坚硬的骨组织，故当骨皮质完整厚度没有改变时，超声检查仅能显示其外形的改变5 .而BMP 在小鼠体内 2128d 时所诱导形成的新骨为疏松的板层状骨，易被超声穿透.值
16、得注意的是，BMP 植入不同的动物中诱导骨生成的时间不同.在小鼠的股部肌肉中，23wk 即可诱导出新的软骨和骨组织，我们的结果也证实了这一点. 在大鼠和狗的肌肉内则分别需要 46wk 和 812wk11 8，因超声检查的特异性低，这些问题应特别注意.另外已研究发现，新生骨生成量与 BMP 植入的量成正比. 图 1 图 4 略 3.3 BMP 环氧乙烷与 射线消毒的比较 BMP 消毒的原则是既要达到灭菌又不能破坏其活性，最常用的方法是环氧乙烷熏蒸.环氧乙烷是一种广谱、高效、穿透力强、对消毒物品损害轻的消毒灭菌剂，其作用机制是使微生物的蛋白质、DNA 和 RNA 发生非特异性烷基化，其消毒效果与浓度、温度、时间及被消毒物品的具体情况有关，浓度高、温度高、消毒时间长则灭菌效果好，但过高的消毒强度可干扰 BMP 的生物学活性.环氧乙烷对消毒物品无直接损害作用，但它有一定的毒副作用，并可能致
