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1、山东大学 硕士学位论文 骨折与细胞因子EGF含量表达之间的关系 姓名：孔庆利 申请学位级别：硕士 专业：骨外科 指导教师：李明 20040420 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：童! 盐日期：= 生：兰：，土 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印
2、件和电子版，允许论 文被查阅和借阅：本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：垒至j导师签名：鸯! ! 三日期：丝辔 骨折与细胞因子E G F 含量表达之间的关系 硕士研究生孔庆利 导师李明 专业骨外科 摘要 目的：通过动物实验，探讨E G F ( 表皮生长因子) 含量表达与骨折问的关 系，从而揭示E G F 促进骨折愈合的机制。 方法：选用成年雄性家兔3 0 只，随机分成3 组( 每组1 0 只) ：骨折加外固 定组( A 组) 、骨折组( B 组)
3、 、创伤组( c 组) 。在制作动物模型前，每只家兔 均由耳缘静脉采血2 m l 。然后制作动物模型：骨折加外固定组采用手法钝性将家 兔左第一跖骨中段折断，然后给予石膏外固定。骨折组仅将家兔左第一跖骨中段 折断，不给予外固定。创伤组用止血钳在左大腿中部钳夹一次，制作成创伤动物 模型。制作动物模型后2 4 小时、4 8 小时、9 6 小时、2 周、4 周，分别由家兔耳 缘静脉采血，每次每只2 3 m l 。在4 C 恒温下放置2 3 小时后，离心、吸取上 清液约l m l ，在一2 0 低温下保存待测。采用放射免疫分析法，试剂盒由中国原 子能科学研究所同位索研究所提供。利用均相竞争抑制原理，采用
4、非饱和( 顺序 饱和) 法对兔血清进行直接测定。表皮生长因子测定结果均建立S P S S 数据资料， 采用S P S S 软件包进行统计分析，对血清E G F 的浓度进行统计处理。因血清E G F 浓度为定量资料，且呈正态分布，所以其统计分析采用t 检验、方差分析，计算 P 值，当P 值大于O 0 5 时认为差异无显著意义，当P 值小于或等于0 0 5 时认为 差异有显著意义，当P 值小于或等于0 0 1 时认为有显著性差异。 结果：1 、动物模型制作后家兔血清E G F 浓度的变化有一定的规律：骨折或 创伤后2 4 小时开始升高，到4 8 小时达到高峰，9 6 小时已开始下降，2 4 周可
5、维持较正常稍高水平，4 周时接近正常值；2 、动物模型制作后血清E G F 浓度与 正常家兔血清一E G F 浓度有明显差异( P 0 0 5 ) 。 这说明上述三组实验动物均来自同一总体样本，样本均数之间无偏差。 2 、动物模型制作后2 4 小时三组动物模型问家兔血清E G F 浓度有显著差异 ( P B 组 c 组，该变化有意义，是由骨折加外固定、 骨折或创伤因素引起，不是偶然现象。 3 、动物模型制作后4 8 小时三组动物模型间家兔血清E G F 浓度有显著差异 fP B 组 C 组，该变化有意义，是由骨折加外固定、骨折或创伤 凶素引起，不是偶然现象。 4 、动物模型制作后9 6 小时三
6、组动物模型间家兔血清E G F 浓度无差异 ( P 0 0 5 ) 。这说明三组家兔骨折或创伤后9 6 小时血清E G F 浓度开始下降，并 r 降到几乎同一水平。 5 、动物模型制作后2 周时三组动物模型间家兔血清E G F 浓度有差异 ( P B 组 C 组。 6 、动物模型制作后4 周时三组动物模型间家兔血清E G F 浓度有显著差 ( P 0 0 1 ) 。这说明三组家兔骨折或创伤后4 周血清E G F 浓度下降更加显著，并 且三组血清E G F 浓度相差较远。 3 9 骨折加外固定或骨折后6 周拍X 线片发现骨折愈合的例数 骨折加外固定组愈合8 例；骨折组愈合5 例。骨折加外固定组根
7、据X 线片检查 愈合例数较骨折组多3 例，骨折加外固定组家兔血清E G F 浓度持续性较骨折组高， 进而可以推断高浓度E G F 有利于骨折愈合。但由于实验动物例数偏小不符合卡 方检验条件，故未进行统计处理。因此得到的此结论仅供参考。有待增加实验动 物例数，进一步验证。 讨论 4 1 骨骼是由中胚层的间充质细胞衍化而成。间充质细胞是一种多功能性 细胞，除可衍化为骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、筋膜、纤维、脂肪等组织外， 尚可衍化为心血管系统和造觑器官。衍化为骨和软骨仅是间充质细胞的功能之 一，按S h e m e n 学说是由某种化学物质诱导而成【1 2 1 。骨组织由细胞外基质、无机 成份以及细
8、胞组成【I “。 骨的细胞成分有【l t ”j ：( 1 ) 成骨细胞：骨表面被一由成骨前体细胞形成的包 膜所覆盖，表现为骨外膜、骨内膜和哈佛管内膜。这些细胞可分化为成骨细胞合 成骨基质，除合成骨基质外，还有一种引起骨质矿化和调节细胞外液和骨液间电 解质流动的作用。一个成骨细胞在3 4 天内可分泌其三倍体积的基质，然后自 身埋于其中，即变为骨细胞。( 2 ) 骨细胞：骨细胞是骨组织的主要细胞，包埋在 坚硬的细胞基质腔隙中，此腔隙称作骨陷窝。骨细胞的胞体有许多细长的突起， 这些细长的突起伸进骨陷窝周围的小管内，此小管又称作骨小管。突出物能使骨 细胞保持在通道的骨内，便于骨与血液之间交换离子和营养
9、。( 3 ) 破骨细胞：破 骨细胞由多核巨细胞( m u l t i n u c l e a rg i a n tc e l l ，M N C , C ) 组成，直径l O O j m a ，含有2 - - 5 0 个核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。破骨细胞的数量较少， 它是由多个单核细胞融合而成的，具有特殊的吸收功能。某些局部炎症病灶吸收 中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程 中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为H o w s h i p 陷窝。 骨基质是由破骨细胞吸收骨产生的吸收隧腔，随即被成骨细胞分泌的基质 充填闭合形成。成人骨
10、无机成分约占2 3 ，有机成分仅占l 3 ，胶原占有机物的 9 0 ，非胶原占有机物的1 0 。骨基质成分有 1 6 , 1 7 】：( 1 ) 胶原：是一种结晶纤维 蛋白原，被包埋在含有钙盐的基质中。胶原的分子结构为三条多肽链。每一条链 含有一千多个氨基酸，分子量为9 5 K U 。这三条肽链交织呈绳状，故又称三联螺 旋结构。胶原分子合成是在成纤维细胞、成骨细胞和成软骨细胞内，同时还合成 和分泌一些非胶原性基质。胶原在生理状态下，是不可溶性结晶样物质。可溶性 胶原是未交联的胶原类型，在生理状态下是固体，但能用冷氯化钠液和冷的稀释 酸溶解。( 2 ) 非胶原蛋白：非胶原蛋白通常约占类骨质的2
11、0 。随着骨的成熟和 钙化，比例逐渐下降，约为6 。目前己发现有多种对于骨的生长、再生、发育 等有重要作用的蛋白质，如骨粘连素、纤维粘连素、骨钙素等。骨粘连素分子量 大小约3 2 K U ，系磷酸糖蛋白，与软骨内成骨过程中软骨钙化区内新骨基质的形 成咀及膜内成骨过程中新骨核的形成有关。与骨磷狄石有强的亲和力，促使游离 钙离子与I 型胶原结合。但纤维粘连素可竟争性抑制骨粘连索促钙离子结合I 型 胶原的作用。纤维粘连素分子量约为2 2 0 K U ，具有两个由二硫键连接的亚单位， 含有能与胶原、肝素和细胞表面结合的位点。( 3 ) 蛋白多糖类：矿化骨组织所含 的蛋白多糖量很少，约占骨有机物的4 一
12、5 ，其化学结构及免疫学特性皆与其 它组织内的蛋白多糖有明显之不同。其分子量大约为1 2 0 K U ，其分子的2 5 为 蛋白质。蛋白多糖类可能抑制骨羟基磷灰石晶体的沉积，因此，在正在钙化的组 织中，蛋白多糖的变化有可能加快组织的矿化。( 4 ) 脂质：脂质约占骨有机基质 的7 一1 4 ，主要分布于细胞外基质泡的膜上和细胞膜上，细胞内结构以及细胞 外的沉积也有脂质的存在，主要为游离脂肪酸、磷脂类和胆固醇等。酸性磷酸脂 与磷酸钙结合形成复合体，参与骨的钙化过程。可钙化的脂蛋白在骨骺软骨开始 钙化时含量最高。( 5 ) 无机物：骨基质中的无机物通常称为骨盐，在电镜下呈细 针状结晶。这些骨盐结晶
13、大都沉积在胶原纤维中。结晶衔接成链，并沿纤维长轴 呈平行排列，其排列方向显示出很强的抗压力效能。无机物占干重量骨的6 5 一7 5 ，其中9 5 是固体钙和磷。钙磷固体是一种结晶度很差的羟基磷灰石。人 骨仅有O 5 的钙是可以交换的。骨质中次要的矿物质是镁、钠、钾和一些微量 元素，包括锌、锰、氟化物和钼等。 骨折是骨的完整性和连续性的中断。骨折的愈合过程可分为三个阶段：血 肿机化演进期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑型期1 1 8 】。( 1 ) 血肿机化期：骨断 裂后，骨髓腔内、骨膜下和周围软组织内出血，形成血肿，血肿于伤后6 8 小 时即开始凝结成含有网状纤维的血凝块。骨折端由于损伤和局部血液
14、供应断绝， 有几毫米长的骨质发生坏死。骨折断端之间、骨髓腔内的血肿凝成血块。它和损 伤坏死的软组织引起局部无菌性炎症反应。新生的毛细血管和吞噬细胞、成纤维 细胞等从四周侵入，逐步进行消除机化，形成肉芽组织。转化为纤维组织。这一 过程约需2 - - 3 周方能初步完成。骨折断端的附近骨外膜深层的成骨细胞在伤后 短期内即活跃增生，约一周后即开始形成与骨干平行的骨样组织，由远骨折处逐 渐向骨折处延伸增厚。骨内膜也有同样的组织学变化，但出现较晚。( 2 ) 原始 骨痂形成期：由骨内、外膜的骨样组织逐渐钙化而成新生骨，即膜内化骨。两者 紧贴在断端骨皮质的内、外两面，逐渐向骨折处汇合，形成两个梭形短管，将
15、两 断裂的骨皮质及其间由血肿机化而成的纤维组织夹在中间，分别称为内骨痂和外 骨痂。骨折断端问和骨髓腔内的纤维组织先逐渐转化为软骨组织，然后软骨细胞 增生、钙化而骨化，即软骨内化骨，而分别形成环骨痂和腔内骨痂。骨折断端坏 死骨亦经爬行替代作用而“复活”。膜内化骨和软骨的相邻部分是互相交叉的，但 其主体部分则前者的发展过程显然较后者简易而迅速，故临床上应防止产生较大 的血肿，减少软骨内化骨范围，使骨折能较快愈合。原始骨痂不断加强，并能抗 拒由肌肉收缩而引起的各种应力时，骨折己达临床愈合阶段。一般需4 8 周。 X 线片可见骨干骨折四周包围有梭形骨痂阴影，骨折线仍隐约可见。病人可拆除 外固定，逐渐恢
16、复日常活动。( 3 ) 骨痂改造塑型期：原始骨痂为不规则的骨小 梁所组成，尚欠牢固，应防止外伤，以免发生再骨折。随着肢体的活动和负重， 在应力轴线上的骨痂，不断地得到加强和改造；在应力轴线上以外的骨痂，逐步 被清除；使原始骨痂逐渐被改造成为永久骨痂，后者具有正常的骨结构。骨髓腔 亦再通，恢复骨之原形。儿童为1 2 年，成人为2 4 年。 骨折愈合是一个复杂的组织变化过程，涉及到一系列不同细胞的活动，包 括细胞的增殖、分化及细胞外基质的合成等。许多学者根据显微镜下疲劳性骨折 愈合过程将骨愈合分为：骨损伤早期；血肿形成期；肉芽组织形成期； 骨痂形成期；骨重建或塑形期【嘲。并且涉及多种细胞和细胞因子的协同作用， 细胞、细胞外基质蛋白及生长因子等在此过程中发生重要的变化。 亦有人将自然骨折愈合过程分为六个不同的阶段，每个阶段具有明显的组 织学和生理学特征【2 。】。( 1 ) 撞击期( i m p a c t ) ：撞击期是指骨开始受到冲击应 力至冲击能量完全消失。( 2 ) 诱导期( i n d u c
