酶标记和免疫层析法技术.

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1、酶标记和免疫层析法技术 黄陂区人民医院 v一、酶联免疫吸附测定法（ELISA） v1、1简介：基本概念： v抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺 激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物 产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或 致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 v抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由 免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性 结合的免疫球蛋白。 v抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、 反应的等比例性 v1.2、ELISA方法简介： vELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由 荷兰和瑞典的学者提出，由于其操作过程简单 易行并可以定量，从而使其在医学检验中得到

2、 了广泛的应用。 v1.3、ELISA方法的原理 v基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以聚苯乙烯塑料微 孔板为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸附 ）在酶标板微孔的内壁上成为包被抗体或抗原，没有被吸附 的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体或抗 原形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附 的酶标记物洗涤去除，在微孔中加入底物溶液，复合物上的 酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。复合物 上酶的量和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进 行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量。这就是 ELISA的原理。 v1.4、ELISA方法的分类 vELISA可

3、以分为直接法、间接法和夹心法等几 种。 v直接法： v直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标 板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复 合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值， 计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图 2-17（a） v间接法： v是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗 原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定 酶反应产物的颜色可以反应一抗和抗原的结合情况，进而计 算出抗原或抗体的量。见图2-17（b） v夹心法： v是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用 酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可 以象间接法一样应用酶标

4、二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合， 形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图2-17（C）。前者 称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。 ELISA原理及分类（图2-17） v上述三种方法又可以分为竞争法和非竞争法。下面对直 接法中的酶标抗原竞争法作重点说明。 v在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测 定孔和对照孔，在对照孔中加入系列标准品溶液和酶标 记物；在测定孔中同时加入酶标记物和非酶标抗原（通 常来自于待测样品），酶标记物和样品互相竞争包被抗 体的结合点，经过温浴后，没有结合到包被抗体上的酶 标记物和样品经过洗涤去除。拍干后加入底物溶液，经 温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪

5、测定吸光度值 。其反应原理如（图2-18） 竞争法ELISA原理（图2-18） 測定孔 E E E E E 酶标记物底物溶液 对照孔 E E E E E E E E E E E E E E E 酶标记物 底物溶液 參考液(不含抗原) E E 樣本(含抗原) 竞争法ELISA原理简述 如图所示.在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测 定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶 标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶 标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原 抗体复合物固定在微孔内，复合物上的酶催化底物使其水解、氧 化还原成为有色的产物。 当

6、测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物 结合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和 酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合 在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在 固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量和酶 产物呈现的色泽成正比，因此可以用酶标仪进行测定，从而计算 出参与反应的抗原和抗体的量。这就是竞争法ELISA的原理。 2、ELISA试剂的组成 v完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂， 俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）

7、系列参考标准品（定量测定）； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液； （7）反应终止液。 v v酶标记物： v即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。 良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保 持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与 抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记 物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶 或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良 好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物 酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。 v酶的底物 v1、

8、HRP的底物 HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的 过氧化物为H2O2，其反应式如下： DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在 ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成 为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有 邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联 苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) v OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应 后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方 便，是HRP结合物最常用的底物。 vTMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜 明。TM

9、B性质较稳定，可配成溶液试剂，只 需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底 物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点， 因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL 或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色， 可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm 。 v洗涤液 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲 液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的 ，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基 团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键 结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并 借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白 质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。 v酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为

10、硫酸 ，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在 板式ELISA中一般采用2mol/L。 v参考标准品 定量测定的ELISA试剂盒应含有 制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保 护剂及防腐剂的缓冲液中。 v v试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实 验中需用的试剂。ELISA实验中应用蒸馏水或 去离子水。自配的缓冲液的PH应用pH计进行 较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与 室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的 部分应及时放回冰箱保存。 v 3、ELISA实验过程 v加样 在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加临介血 清、加样本、加酶标记

11、物、加底物、加反应终止液。 加样时应将所加物品加在LEISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 加样时一般用微量加样器，按规定的量加入板孔 中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加 酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器 ，使加液过程迅速完成。 v v保温 在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一 次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定 的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation) 。 vELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固 相表面上发生。加入板孔中的标本，其中的抗原并 不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近

12、孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一 个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的 终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合 也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一 定时间的温育。 v 洗涤 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤 ，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗 涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的 。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗 原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特 异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯 等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤 时又应把这种非特异性吸附的干扰物 质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是 最主要的

13、关键技术，应引起操作者的高度重视 ，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 v洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪 外，手工操作主要为浸泡式，过程如下： a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍 （将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，即将洗 涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间 不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用 水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸 水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗涤3-4次（或按说 明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数 或延长浸泡时间。 v 显色 显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催 化无色的底物

14、生成有色的产物。反应 的温度和时间仍是影响显色的因素。在定量测定中 ，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确 。 v 底物显色一般在室外温或37反应20-30分钟后 即不再加深，约40分钟将达到显色的顶峰，再延长 反应时间，可使本底值增高。底物液受光照会自行 变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入 终止液终止反应。产物用各类酸性终止液终止后会 使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm ）测读吸光值。 比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液 体，然后将板正确放入酶标比色仪的比 色架中。 比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence ，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收 波长写于A字母的右下 角，如TMB的吸收波长为450nm，表示方法为 A450nm或OD450nm。 v 酶标比色仪 酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测 读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的检测 范围一般在0.0003.000之间，甚至更高。超 出可测上限的A值常以*或over或其它符号 表示。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下， 操作时室温宜在1530，使用前先预热仪器 15-30分钟，测读结果更稳定。