中华眼镜蛇毒组分抑制血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究

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1、广州医学院 硕士学位论文 中华眼镜蛇毒组分抑制血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究 姓名：刘新艳 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：余清声 20040526 广州医学院硕j 学位论文中华眼镜蛇毒组分抑制血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究 H U V E C S M C H L F H B E A O F C M T T R G D P I D M S O E D T A F B S P B S V E G F b F G F v W F I L G P C A M 英汉名词缩略语 h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a

2、lc e l l s人脐静脉内皮细胞 s m o o t hm u s c l ec e l l s平滑肌细胞 h u m a ne m b r y o n i cl u n gf i b r o b l a s t人胚肺成纤维细胞 h u m a nb r o n c h i a l e p i t h e l i u mc e l l s 人支气管上皮细胞 a c r i d i n e o r a n g e 吖啶橙 f l o wc y t o m e t e r流式细胞仪 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 - y 1 ) 一2 ，

3、5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e 四氮唑 A r g G l y A s p 精一甘一天冬氨酸 p r o p i d i u mi o d i d e 碘化丙啶 d i m e t h y l s u l f o x i d e二甲基亚砜 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d乙二胺四乙酸 f e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清 p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i

4、n e磷酸缓冲盐水 v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r血管内皮生长因子 b a s i cf i b r o b l a s t g r o w t hf a c t o r 碱性成纤维细胞生长因子 v o nW i l l e b r a n df a c t o rV O UW i l l e b r a n d 因子 I n t e r l e u k i n白细胞介素 G l y c o p r o t e i n 糖蛋白 c h i c kc h o r i o a l l a n t o i cm

5、e m b r a n e鸡胚绒毛尿囊膜 广州医学院硕j 学位论文 中华眼镜蛇毒组分抑翎血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究 中华眼镜蛇毒组分抑制血管内皮细胞增殖 及其机制的实验研究 广州医学院广州蛇毒研究所 研究生：刘新艳 导师：余清声教授 摘要 第一部分中华眼镜蛇毒活性组分抑内皮细胞增殖的作用 目的：观察中华眼镜蛇毒活性组分( N a j an a j a A t r av e n o m a c t i v ef a c t o r ，N N A V A F ) 对内皮细胞增殖的选择性抑制作用。 方法：采用倒置显微镜、酶标仪分析不同浓度N N A V A F 对人脐静脉内皮细胞系 E C

6、V 3 0 4 生长增殖的影响；分析不同浓度N N A 、，A F 作用下人脐静脉内皮细胞系 E C V 3 0 4 、S D 大鼠平滑肌细胞( S M C ) 、人胚肺成纤维细胞H L F 以及人支气管上 皮细胞H B E 生长增殖的变化；并运用直线回归分析统计对比N N A V A F 对上述各细 胞的I C 5 0 。 结果：N N A V A F 可以抑制内皮细胞的生长，呈剂量及时问依赖性：6 h 即出现抑制 作用，2 4 h 抑制作用最强，6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 其I c 5 0 分别为4 9 5 5 9 9 m l ， 4 9 3 2 1 x

7、 g m l ，2 4 4 3 9 9 m l ，3 0 4 8 9 9 m l ，3 1 3 3 9 9 m l ；观察作用2 4 h 时浓度与抑制作 用的关系，0 6 2 5 9 9 m l 即有作用，抑制率为4 4 1 ，1 2 5 9 9 m l 一2 0 1 x g m l ，抑制率 分别是3 0 9 4 、6 1 8 1 、8 6 1 7 、9 6 0 5 、9 8 6 8 ，1 0 9 9 m l 抑制率即达高峰， 此后进入曲线的平台期，各浓度组抑制作用与阴性对照组相比有显著差异 ( p 0 ，0 5 ) ，未 出现阳性峰：比色法测定c a s p a s e 3 活性，可见1

8、2 5 g m l 组c a p a s e 3 活性即出现升 高，且有浓度依赖性，从1 2 5 i a g m l 1 0 t a g m l ，O D 值分别为1 6 5 1 4 - 0 1 9 4 、2 2 7 7 士0 2 0 8 、 2 4 9 7 士0 1 2 0 、3 6 4 7 士0 1 8 2 ，与阴性对照相比差异有显著性( p d=：*一oov d：誓8od：-u罂g掣墨坷。燃 o n 薯：o宝“竺o ! 卜吼 l：!oo刊竹兽o 心小 ；聋畚ooo喜10o t A 誊：卜ooo训=800o 2 昏 ：母ooo卅=oo n *-o寸oo书寸一o 一西寸小 *onoo卅N心o

9、o ”o 心乱 -+。乱ooo刊一寸oo 呐叶n 口 。*noo书【寸oo N 冀N 盘 *。寸ooo刊昏，oo 卜口小卜 *Noo书也一o n 也卜 -*寸Noo州nn一o 卜一 ，寸一oo千寸寸_o N t n n t*-o寸oo刊寸昏qo t N n *noo刊叽寸甘o n t 寸n 荽各Noo刊!qo 西吐n 寸 口一o君_0口也o 1 8 1 9 ：!oo州心西o 乱一2 毒8寸oo刊小岛o 凸! ：荔noo州60o o *nnoo刊小口西o 乱n 甘 *一Noo刊。卜一一 甘乱o n *Nnoo刊卜一卜o n 一” o nHoo卅oH小o o -_noo千0卜，一 一t 寸 -nH

10、oo刊一昏凸o H ， o nnoo州n一小o o t，一oo卅nNN一 o n寸oo刊no一 。 西H。州=母o 。 口loo卅。寸乱。 一措抟譬一囊蛆虫一 一誉一时幂晕 坦凸。 一享一姆器晕 迥o o 一邑褂器晕 趔o o 邑褂亲晕 理o o 一摹一辟器晕 留口。 一I暑3赵鹾 v v Z Z 6 = q 刊K v瓣器嚣蛊苫cAu闺按扈茁匪壮叵悻槲l!I瘩zz P 氍 装高翻林g器皋三罂墓蠹赵墨姐一暑喜章太蠹啪髫嚣警罟岳 文强g扑器班扑鹾：o一 广州医学院硕j 学位论文中华眼镜蛇毒组分抑制血管内皮细胞增殖及其机制的实验研究 的量效曲线相比，明显右移。这就表明与粗毒相比，N N A V A

11、F 的抑制作用明显增 强。 表2 租毒与E C V 3 0 4 作用2 4 h 各浓度抑制率( i s ，n - - - 9 ) 注：与阴性组相比，”：p o 叭，”+ ：p 0 0 5 1 3N N A V A F 各个时间段对E C V 3 0 4 抑制作用的I C s o 结果 根据表3 ( 见2 0 页) 中的数据，求得的抑制率应用S P S S 软件作直线回归分 析，得出6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 的回归方程分别是：抑制率6 h ( ) = 7 ，8 8 6 + 6 0 6 0 1 l o g 浓度( F 0 9 4 1 ，p 0 0 1 ) ；抑

12、制率1 2 h ( ) = 8 0 6 9 9 X l o g 浓度一5 9 2 1 ( 产O 9 6 2 ，p 0 0 1 ) ：抑制率2 4 h ( ) = 1 8 2 5 1 + 8 1 7 7 2 X l o g 浓度( F O 9 9 1 ，p 0 0 1 ) ： 抑制率4 8 h ( ) = 4 7 9 6 + 9 3 4 8 5 l o g 浓度( r = O 9 9 0 ，p 0 0 1 ) ；抑制率7 2 h ( ) = 6 2 6 4 + 8 8 1 6 7 l o g 浓度( r = 0 9 7 3 ，p 0 0 I ) ，将抑制率= 5 0 代入方程求出6 h 、1 2

13、 h 、2 4 h 、 4 8 h 、7 2 hI C 5 0 分别为4 9 5 5 9 9 m l ，4 9 3 2 p , g m l ，2 4 4 3 9 9 m l ，3 ，0 4 8 1 a g m l ，3 1 3 3 I _ t g m l ， 由此可以看出，伴随作用时间的延长，I c 5 0 逐渐降低，也就是N N A V A F 强度随时 间逐渐增大，在2 4 h 已达高峰，时间继续延长，作用并不增加。 2 N N A V A F 抑制E C 、，3 0 4 生长作用的相对特异性结果 2 1N N A V A F 对E C v 3 舛的抑制优于对S M C 、I t L F

14、、H B E 作用 N N A V A F 与各细胞作用2 4 h 后，对内皮细胞在0 6 2 5 9 9 m l 即表现出一定的抑 制作用，抑制率为4 4 l ，随后随浓度的逐渐增大，抑制率逐渐升高， 1 2 5 0 9 m 1 2 0 r t g m l ，抑制率分别是3 0 9 4 、6 1 8 1 、8 6 1 7 、9 6 0 5 、9 8 6 8 ， 从附图5 ( 见5 8 页) 中可以看出1 0 9 9 m l 时抑制率己基本达到最高峰，以后即开 始进入一个平台。而从附图6 ( 见5 9 页) 、表4 ( 见2 1 页) 中可见对H L F 的抑制 1 9 一o 。o v d=：

15、。Io。v d：兽ov d：*j且罂矗扭区寸。干5 导吨N N n m 口 器口 I岛悟l恒 n q 寸 *卜一oo刊寸寸一o ”西呐 noo千0呐oo 寸q N 凸 nNoo喇一oo 卜c N -。崞ooo州N一一o n n 卜卜 _-。一noo刊一一Ho o 一磊 #品苫o剞口!o 窨c 6 ：备。oo刊琵oo 小N N 口 善N。o州赛oo 心o 卜卜 ：各Hoo刊心!o 1 1 o 卜 ：8笤o千Iqo 呐口H *一oo刊吗n一o 寸 -。崎ooo刊卜nIo 小N o 西 *-onoo刊一。一o n o o 卜 -呐Hoo-0口Io 一卜崎 *noo划_60 c o 一寸o *oNoo刊小卜一o o 卜心 *oo0千n_【o 寸一 *寸Ioo刊nN一o 一乜n o *一Noo刊Nn一o n 口小n *。卜no)干oco 卜1 一 *nH。州一卜一o n c n *No0千昏卜一。