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1、华中科技大学 硕士学位论文 糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素分泌的影响 姓名：徐群 申请学位级别：硕士 专业：心血管 内科 指导教师：刘正湘 20070401 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素 分泌的影响 糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素 分泌的影响 研究生：徐 群 导 师：刘正湘 教授 华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科 研究生：徐 群 导 师：刘正湘 教授 华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科 中文摘要 中文摘要 目的：目的：本研究通过观察在糖尿病机体
2、内含量明显升高的糖基化终末产物 （Advanced glycation end product，AGE）对小鼠3T3-Ll细胞中脂联素 （Adiponectin， APN）mRNA及蛋白表达的影响，来探讨AGE致动脉粥样硬化的可 能作用途径，以便为糖尿病动脉粥样硬化的防治研究提供更多的理论支持。 方法：方法：糖孵育法 1制备 AGE-BSA，荧光分光光度计测量其荧光值，BSA 作对 照。将小鼠 3T3-L1 前脂肪细胞体外培养并诱导分化为成熟的脂肪细胞。用含不 同浓度梯度（50g/ml、100g/ml、150g/ml）AGE 的培养液对成熟的脂肪细胞 体外培养 48h，以 PBS 和 BSA
3、作为阴性对照，分别收集细胞和上清液，用 RT-PCR 方法测量 APN mRNA 的表达，ELISA 方法检测培养液中 APN 的分泌情况。 结果：结果：1）荧光分光光度计测得 AGE-BSA 组的荧光值 12.25 远远高于 BSA 组 的荧光值 0.42（分别稀释 10 倍后） ，符合 AGE 的荧光特性。2）3T3-L1 前脂肪细 胞体外分化成熟后，高倍镜下观察细胞内可见到明显的脂滴，油红 O 染色可见胞 浆明显着红色。3）AGE 干预成熟的脂肪细胞后，APN 的 mRNA 水平较对照组明显 下降，而 BSA 对照组与 PBS 对照组 APN mRNA 的表达无差异，用 50g/ml A
4、GE 干 预脂肪细胞后， APN mRNA 的表达较对照组减少 （P0.05） ， 当 AGE 浓度达 100g/ml 和 150g/ml 时，APN mRNA 的表达较对照组有显著差异（P0.001） 。用 ELISA 法 测细胞培养上清中 APN 分泌，则有相似的发现，随着 AGE 干预浓度的升高，APN 的分泌逐渐减少，并且与对照组相比差异均具有统计学意义（P0.05） 。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 结论：结论：AGE 参与了对 3T3-L1 脂肪细胞脂联素表达的调节，它能够通过抑制 3T3-L1 细胞 APN m
5、RNA 的合成，近而抑制 APN 的分泌，且这种抑制作用呈浓度依 赖性。 关键字：关键字：糖基化终末产物；脂肪细胞；脂联素；动脉粥样硬化 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 Effect of Advanced Glycation End Products on the Expression of Adiponectin in 3T3-L1 Adipocytes Candidate: XU Qun Supervisor: Prof. LIU Zhengxiang Department of Cardiology of Tongji
6、 Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology Abstract Objective：To explore the effect of advanced glycation end products on the mRNA and protein expression of adiponectin in 3T3-L1 adipocytes. So as to provide more theory support for prevention and cure of diabete
7、s mellitus complicating atherosclerosis through founding the mechanism of action about AGE. Method：To prepare AGE-BSA, BSA was incubated with glucose in sodium phosphate buffer (pH 7.4) at 37 oC for 60 days and dialyzed against PBS. Adipocytes were cultured and differentiated in vitro until mature a
8、dipocytes. These cells were incubated for 48 hours in the presence of 50g/ml、100g/ml、150g/ml AGE-BSA, followed by assay for adiponectin synthesis and secretion by these cells. We established 2 control groups, unmodified BSA and phosphate-buffered saline (PBS). Adiponectin mRNA was quantitated by RT-
9、PCR, while adiponectin concentrations in the culture medium were determined by ELISA kit. Result：1) By fluorospectrophotometer, we measure the fluorescence data of AGE-BSA is 12.25 while that of the BSA is just 0.42 after diluting 10 times respectively. The result meets the fluorescence characterist
10、ic of AGE. 2) There were lots of fat droplets in the mature adipocytes from the high power lens, and they are colored red by Oil Red O. 3) Having no significant difference between unmodified BSA and PBS. Adiponectin in differentiated adipocytes incubated with 50g/ml AGE-BSA is less than that of the
11、control groups (P0.05). However, adiponectin is 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 inhibited significantly in presence of the 100g/ml、150g/ml AGE as compared with that of the control groups(P0.001). We survey the adiponectin concentrations by ELISA kit and get identical result. Along
12、with the increasing AGE concentration, adiponectin expression is gradually decreasing. Conclusion:：These results clarify that AGE-BSA are able to inhibit adiponectin synthesis at a mRNA level, leading to reduction in adiponectin secretion from these adipocytes, and this inhibition presents a dose-de
13、pendent manner. Keyword：Advanced Glycation End Products；Adipocyte；Adiponectin； Atherosclerosis 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 35 缩略词及中英文对照 ABBREVIATION APN Adiponectin，脂联素 AGE Advanced glycation end product, 糖基化终末产物 BSA Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白 mRNA messenger RNA，信使 RNA Rnasin Rn
14、ase inhibitor, RNA酶抑制剂 PPAR Peroxisome proliferator-activated receptor, 过氧化物酶体增 殖物活化受体生物激活受体 PAI Plasminogen activator inhibitor，纤溶酶原激活物抑制剂 ，纤溶酶原激活物抑制剂 TNF- Tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子 HB-EGF Hepatoblastoam epidermal growth factor，肝素结合性表皮生 长因子 VSMC Vascular smooth muscle cell，血管平滑肌细胞，血管平滑肌细胞 VEC Va
15、scular endothelial cell，血管内皮细胞，血管内皮细胞 MP Macrophage，巨噬细胞，巨噬细胞 CHD Coronary heart disease，冠心病，冠心病 IGF Insulin-like growth factor，胰岛素样生长因子，胰岛素样生长因子 DEPC Diethyl pyrocarbonate，二碳酸二乙酷 DMSO Dimathyl sulfoxide，二甲亚讽 EDTA Ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸 PMSF Phenylmethyl sulfonylfluoride，苯甲基磺酰氟化物，苯甲
16、基磺酰氟化物 PBS Phosphate-buffered saline, 磷酸盐生理盐水缓冲液 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay, 酶联免疫吸附测定法 RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction，逆转录聚合 酶链反应 AMI Acute myocardial infarction，急性心肌梗塞，急性心肌梗塞 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 36 UAP Unstable angina pectoris，不稳定性心绞痛，不稳定性心绞痛 SAP Snstable angina pectoris，稳定性心绞痛，稳定性心绞痛 ACS Acute coronary s
