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1、第九讲 固定化酶与固定化细胞,固定化酶(Immobilized Enzyme） 20世纪60年代发展起来的一项新技术 以往使用的酶绝大多数是水溶性酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展 60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用 曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转
2、向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究,固定化酶,固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点： (1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺 (2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性 (5) 较能适应于多酶反应 (6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低,固定化酶,固定化酶也存在一些缺点： (1) 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大 (2) 比较适
3、应水溶性底物和小分子底物 (3) 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应。同时，对胞内酶需经分离后才能固定化,固定化酶,酶的固定化方法,吸附法；共价结合法；交联法；包埋法,固定化酶,吸附法,吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，制成固定化酶 有机载体，纤维素、骨胶原、淀粉等 如，用纤维素作为吸附剂吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70 mg/cm2,无机载体，氧化铅、高岭土、多孔硅、多孔玻璃等 如，用多孔硅为载体吸附淀粉酶，在45进行固定
4、化，用高浓度底物 进行连续反应。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落,固定化酶,(2)离子交换吸附法: 将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法 酶吸附较牢，在工业上具广泛用途 常用载体： 阴离子交换剂，二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶 阳离子交换剂，羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐,固定化酶,通过酶蛋白化学修饰增加蛋白质分子上电荷，能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸 如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用DEAE-纤维素载体有
5、效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附 此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关 pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少 盐可以促进蛋白质的吸附，即所谓盐析吸附 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降 载体的表面积、多孔性及其预处理都影响对酶的吸附,固定化酶,吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用 但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于
6、吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性,固定化酶,交联法,利用双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶与载体间进行交联反应，以制备固定化酶的方法 最常用的交联试剂是戊二醛，用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下：,固定化酶,交联方法： (1) 交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶 如：木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH 5.2-7.2、0 下 交联24h，可形成固定化酶,这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力 如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L 醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温
7、下放置10-30min，会有沉淀析出，1-3h内反应结束。形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶,固定化酶,(2) 载体交联法 用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法 单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果,固定化酶,共价结合法 酶蛋白侧链基团和载体表面功能基团之间形成共价键而固定的方法 其优点：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失 活，同时，制作手续亦较繁琐 酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基
8、团有以下几种： 酶蛋白N-端的氨基或赖氨酸残基氨基 酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基和Glu残基的羧基 Cys残基的巯基 Ser、Tyr、Thr残基的羟基 Phe和Tyr残基的苯环 His残基的咪唑基 Trp残基的吲哚基,固定化酶,在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性,(2) 载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是: 一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定性上都优于疏水载体 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度 载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团 载体没有或很少有非专一性吸附
9、 载体来源容易，并能反复使用,(3) 偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素,固定化酶,如，重氮法 将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH 8-9)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶,固定化酶,含醛基高聚物、多糖类，如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄
10、糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶,固定化酶,例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶,载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6 NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL尿素溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处理12h，用水洗涤，除去过量甲醛,加酶固定: 上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下4-8固定18h，用pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干
11、，即为固定化酶,包埋法 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶。对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用 但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低 包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法,固定化酶,(1)凝胶包埋法 将酶分子包埋在凝胶格子中, 聚丙烯酰胺凝胶包埋法 一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mg
12、N，N-甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸铵(引发剂)，混合，于室温保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒，于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶,聚丙烯酰胺包埋法的缺点：酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服,固定化酶, 辐射包埋法 酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中，在常温或低温下，用X-射线、Y-射线或电子束辐照，可得到包埋酶的亲水凝胶
13、如，用X-射线引发丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶 1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶 运用弱水性或稍具疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚合，可用于一般生物物质的固定化，这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，长期使用后仍有较高的活性,固定化酶,(2) 微囊化法 将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内 酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触，从而增加了酶的稳定性 小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出 微囊一般直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡
14、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞 因此，此法在医疗上应用极为广泛。例如，固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊,固定化酶, 界面沉淀法 利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法, 界面聚合法 将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中,固定化酶,微胶囊的制备方法, 红血球包埋法 在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球，再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出, 脂质体包埋法 采用双层脂质体形成极细球粒
15、包埋酶,固定化酶的性质,固定化酶活力 与溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有： 酶与不溶性载体相结合引起结构变化； 酶活性中心重要氨基酸残基与载体相结合； 载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降 在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致,活力回收和相对活力 酶固定化一般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收,固定化酶,固定化酶活力测定 基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示。即每毫克干重固定化酶每分钟转化1mol底物量或形成1mol产物的酶量为一个单位(mol/mgmin)，对于酶管、
16、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示,固定化酶,固定化酶的稳定性 大多数酶在固定化后都不同程度提高了稳定性，延长了有效寿命 固定化增加酶构象的牢固程度 阻挡不利因素对酶的侵袭 限制了酶分子间的相互作用 但如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降,热稳定性 大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高热稳定性，这种性质对工业上的应用有益 如，氨基酰化酶，溶液酶在75保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力。CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5-15 其他，如固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高,固定化酶,pH-酶活力关系 反应的最适pH和pH-酶活力曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反 尽管大多数固定化酶的活力
