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1、第四章 DNA的复制第四章 DNA复制 (DNA Replication) 1主要内容1)DNA复制概览2)细菌DNA复制3)真核DNA复制2教学要求1)掌握原核生物和真核生物DNA的复制特点2)熟悉原核生物和真核生物DNA复制的酶系统第一节 DNA复制概述第二节 DNA复制的酶学 第三节 原核生物DNA复制第四节 真核生物DNA复制第一节 DNA复制概述 (DNA Replication: An Overview) 一、基本概念二、DNA的半保留复制三、复制起点、方式和方向四、DNA复制的半不连续性一、基本概念复制子(Replicon，复制单位或复制元)o DNA中含有一定复制起点和复制终点
2、的复制单位。 1.3万 90万不等 A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator 复制体(Replisome)：复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。oThe multio protein (30) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA二、DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication） CsCl (Cesium chlorid
3、e) density gradient ultracentrifugation（ CsCl密度梯度超离心）Labeled E.Coli DNA with 15N 14No 三、复制起点、方向和方式All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制子）1、复制起点（origin，ori 或 O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即整个染色体只有一个
4、复制单位真核生物（Eukaryote）： 多复制起点，即一个genome中有多个复制单位 2、复制方向（复制过程的顺序性）复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子 多个复制眼（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉（2） 复制的多模式 单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向(原核)多起点、双方向（真核）3、复制方式（1） 从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ replica
5、tion fork ）（2） 置换式（ Displacement form）又称 D 环复制 （3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）DNA复制方式（1）从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式（ replication fork ）或 复制A replication eye forms a theta structure in circular DNA.o（2） 置换式 Displacement form ，又称 D 环复制 线粒体和叶绿体 DNA的复制方式（3）共价延伸方式（co
6、valence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）由于复制时产生的滚环结构形状象，又称复制病毒、细菌因子四、DNA复制的半不连续性（Semi-Discontinuous Replication） 复制方向的问题： 冈崎片段（Okazaki fragment） 1968年冈崎（Reiji Okazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilselabeling experiment）。冈崎利用T4噬菌体侵染E.cili(t-)菌株，并分别用dTTP(3H-T)进行2，7,15,30,60,120的脉冲标记，分离提取T4噬菌体DNA，变
7、性后，进行Cscl密度梯度离心，以检测具放射性的沉降片断，判断片断大小。结果表明经不同标记时间的，被3H-T标记的新合成的DNA片段几乎都为10-20s，即均为1000-2000核苷酸大小（图3-）。第二组实验是脉冲追踪实验（pulsechase experiment），为了研究在脉冲标记实验中所发现的1020s的小片段在复制全过程中的发展结局，冈崎将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分钟，分离DNA进行密度梯度离心，发现小片段已被连接成为70120S的大片段。为此将DNA的这种复制方式称为不连续复制模式，将最初合成的1020s片段称为冈崎片段（图3）。如果两条极
8、性单链的DNA复制均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链暴露到10002000核苷酸长度后，开始从5 3合成冈崎片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按冈崎片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。换言之, DNA的复制应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续复制的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续复制的方式完成冈崎片段的合成。但在Okazaki的脉冲标记实验结果中，被标记的DNA全部为小片段。其实在E.coli的细胞内存在dUTP和dTTP两种类似物, 其比例大约为1：300，而DNA聚合酶III又不能区分这两者，一旦将dUMP聚合到DNA分子中，必然
9、会导致生物的基因表达与进化过程中的潜在危险，实际上E.coli 依靠了两种机制阻止了dUMP 掺入到DNA分子的过程。由dut基因编码的dUTP酶（dUTPase）能有效地将dUTP，dUDP分解为dUMP,从而避免了dUMP作为底物而掺入到DNA分子中。即使dUTPase能将绝大部分的dUTP降解，但仍有约11200的几率dUTP分子的逃逸，细胞内的ung基因编码的尿嘧啶N糖苷酶（ungase）可以迅速地将已经掺入到DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinic 或apyrimidinic），再由Ap内切酶进一步将Ap位点酶解成缺口，以与其对应的亲代链为模板 重
10、新聚合和连接，完成切补修复过程. 显然在先导链合成的初期过程中，约1200个核苷酸就有一个dUMP被切除的可能，在Ap内切酶未完全作用前提取DNA并进行变性分析，就会得到与冈崎片段相似大小的10002000核苷酸的片段，这种片段也被称为dUMP片段，Okazaki对dut和ung两种突变体的研究结果证实。在dut突变体的脉冲标记实验中，由于dUMP掺入的几率增加，冈崎片段变短。而在ung突变体的脉冲标记实验中，由于已掺入的dUMP被切除的几率降低，冈崎片段变长。冈崎选用连接酶突变体（lig-）进行的脉冲追踪实验中，先导链的dUMP片段均不能被连接成大片段，（图3）。进一步证明了在脉冲标记实验中
11、后随链的冈崎片段与先导链的dUMP片段均以相似大小表现在其研究结果中。1978年Olivera据此提出了DNA复制的半不连续模式。第二节 DNA复制的酶学(Enzymology of DNA Replication)复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种高分子物质共同参与.DNA复制的体系底物： dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP)聚合酶（polymerase): DNA-pol 依赖DNA的DNA聚合酶(DDDP)模板（template): 解开成单链的DNA母链引物（primer): 寡核苷酸片段,提供3-OH末端,使dNTP聚合其它酶和蛋白质因子: 解链酶，解旋酶，单链
12、结合蛋白，连接酶一、DNA聚合酶二、DNA连接酶（DNA Ligase）三、与DNA几何学性质相关的酶 一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。(一) DNA聚合酶催化的反应 53的聚合活性 53外切酶活性 35外切酶活性 1、5至3的聚合活性 催化四种dNTP以磷酸二酯键一个一个地接到DNA链上去 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应的特
13、点： (1) 以单链DNA为模板 (2) 以dNTP为原料 (3) 引物或DNA链提供3-OH (4) 聚合方向为532、 35 外切核酸酶活性 校对功能(proofreading)3、 53外切核酸酶活性(二)原核生物的DNA聚合酶（E.coli） 1957 Arthur Kornberg 首次发现l In fact, there are 5 polymerases to date, although we will focus only onw 3DNA pol nDNA pol nDNA pol n1. DNA Polymerase I2. DNA Polymerase 和 DNA po
14、l ：5 3聚合酶活性及3 5外切核酸酶活性。lDNA pol :l 由10个亚基组成，分别为、及。是原核生物体内真正起复制作用的酶。亚基： 5 3聚合酶活性亚基：3 5外切酶,校对和编辑亚基为装配所必须 亚基决定了Polb III全酶的持续合成能力3. 三种大肠杆菌DNA聚合酶特性之比较 三种大肠杆菌DNA聚合酶的主要功能DNApol-主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复。oDNApolo -是主要的修复酶DNApolo -是主要的复制酶三种DNA聚合酶在决定DNA合成方面的共同特性三种酶都只有聚合酶的功能，而没有聚合酶功能，说明DNA链的延伸只能从5向3端进行。他们都没有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下进行链的延伸，因此，DNA的合成必须有引物引导才能进行。三种酶都有核酸外切酶的功能，可对合成过程中发生的错误进行校正，而保证DNA复制的高度准确性。 为什么子链DNA延伸方向只能是5 3二、DNA连接酶（DNA Ligase）催化单链DNA切口上5-P和3-OH形成磷酸二酯键三、与DNA几何学性质相关的酶 (一) 解螺旋酶 (helicase) 模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。l解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质
