凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌致病性分子标志物的建立与应用致病性分子标志物的建立与应用姜美娟姜美娟姜美娟姜美娟中国人民解放军第中国人民解放军第中国人民解放军第中国人民解放军第401401医院医院医院医院 1 1、立题依据、立题依据u凝固酶阴性葡萄球菌（凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）广泛存在于人体皮肤、）广泛存在于人体皮肤、黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置管等各种标本中检出管等各种标本中检出 文献报道，文献报道，1995-1996年美国年美国48个医学中心个医学中心2596份份血标本中，血标本中， CoNS的分离率达的分离率达32.2% 尽管血液等无菌体液培养出尽管血液等无菌体液培养出CoNS临床意义较大，临床意义较大，但据报道单次血培养但据报道单次血培养CoNS污染的可能性仍高达污染的可能性仍高达85%。
第一部分第一部分 研究背景和意义研究背景和意义2 u近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛使用，的广泛使用，CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而且已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见 叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有40%-50%由凝固酶阴性葡萄球菌引起；由凝固酶阴性葡萄球菌引起； 2009年中国年中国CHINET细菌耐药监测结果细菌耐药监测结果MRCoNS检检出率平均为出率平均为71.7%,大于大于MRSA的的52.7%研究背景和意义研究背景和意义3 uCoNSCoNS 作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被分离出来，常常引起临床困惑其是否能作为感染的分离出来，常常引起临床困惑其是否能作为感染的病原菌是临床关心的问题病原菌是临床关心的问题u有鉴于此，有鉴于此，实验室建立对实验室建立对CoNS污染菌和致病菌界定污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方案的重要前提案的重要前提 。
研究背景和意义研究背景和意义4 CoNS致病物质u在在 CoNS 感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以清除的生物膜是其最为重要的致病机制清除的生物膜是其最为重要的致病机制 ；；u其中其中CoNS产生的产生的多糖胞间黏附素（多糖胞间黏附素（polysacchatide intercellular adhesion，，PIA））是细菌生物膜形成聚集阶是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定其致病性的物质基础其致病性的物质基础u Heilmann 等发现等发现 ica 操纵子操纵子对合成对合成 PIA 以及在细菌形以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用成成熟的生物膜中起到非常重要的作用 研究背景和意义研究背景和意义5 ica 基因结构uica 基因座定位于细菌染色体，全长基因座定位于细菌染色体，全长 3.4 kb，包括，包括 icaR 调节基调节基因及串联存在的因及串联存在的 icaA、、icaD、、icaB 和和 icaC 结构基因结构基因 其中，其中，icaADBC 4 个基因构成一个操纵子，可以通过检测个基因构成一个操纵子，可以通过检测 icaADBC 基因来反映基因来反映ica 操纵子的存在。
操纵子的存在 icaB 不直接参与胞间黏附素的合成不直接参与胞间黏附素的合成,因为重组因为重组icaADC 就能就能使细胞积聚；使细胞积聚； icaA 单独呈现低的单独呈现低的N-乙酰葡糖胺转移酶活性；乙酰葡糖胺转移酶活性； icaC涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面；涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面； 生物膜的形成要求生物膜的形成要求icaD编码的产物具有最佳活性编码的产物具有最佳活性 因此因此,我们选择了我们选择了icaD 作为本试验的目的基因片段作为本试验的目的基因片段研究背景和意义研究背景和意义6 u获得获得CoNS特异的致病性分子标志物；特异的致病性分子标志物；u确立敏感、准确、快速的医院感染相关性确立敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS特异基因诊断方法；特异基因诊断方法；u能够准确鉴定致病性与非致病性能够准确鉴定致病性与非致病性CoNS研究背景和意义研究背景和意义 2、实验目的、实验目的 7 研究研究CoNS的生物标志物对该菌在医院获的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和经济价值。
经济价值研究背景和意义研究背景和意义 3、临床意义、临床意义8 u阴性对照：表皮葡萄球菌阴性对照：表皮葡萄球菌ATCC12228，购自中国，购自中国药品鉴定所，经基因组测序证明其药品鉴定所，经基因组测序证明其ica操纵子缺失操纵子缺失 ；；u阳性对照：表皮葡萄球菌阳性对照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金医院倪语，瑞金医院倪语星教授惠赠，含有完整星教授惠赠，含有完整ica操纵子；操纵子；u待测样本：自待测样本：自2006年年1月至月至2007年年9月，收集我院月，收集我院临床各科室共临床各科室共114例疑是感染性标本例疑是感染性标本 第二部分第二部分 材料和方法材料和方法1、研究对象、研究对象9 2、主要试剂、主要试剂u培养基：培养基： 哥伦比亚琼脂培养基、哥伦比亚琼脂培养基、 刚果红琼脂刚果红琼脂 培养基、培养基、 LB肉汤增菌液肉汤增菌液u引物：引物： SodA引物引物（（ 5‘-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3’ 及及 5‘-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3’）；）； icaD引物引物（（5‘-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3’及及 5‘-GTCACGACCTTTCTTATATT-3’）；）； 16S rDNA 引物引物（（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’及及 5‘-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3’）。
材料和方法材料和方法10 3、主要仪器设备、主要仪器设备uPCR仪：仪：PTC100 PCR仪，美国仪，美国MJ Research Inc.；；u恒压恒流电泳仪、电泳槽：恒压恒流电泳仪、电泳槽：DF-C型，北京东方特力科贸型，北京东方特力科贸中心；中心；u凝胶成像系统：凝胶成像系统：GDS8000 ，美国，美国UVP Inc.；； u核酸核酸/蛋白定量仪：蛋白定量仪：DU640，美国，美国Beckman；；u酶标仪：美国雷杜，深圳组装；酶标仪：美国雷杜，深圳组装；uATB Expression：法国：法国bioMérieux Inc；；u生物安全柜：生物安全柜：BSC-1500Ⅱ B2，济南鑫贝西生物技术有限，济南鑫贝西生物技术有限公司；公司；u全自动快速微生物培养检测系统：全自动快速微生物培养检测系统：BacT/ALERT 3D 60，，法国法国bioMérieux Inc；；材料和方法材料和方法11 4、实验设计及方法、实验设计及方法标本采集标本采集阴、阳性对照阴、阳性对照菌种鉴定菌种鉴定PIA检测检测PCR扩增扩增icaD基因基因sodA基因基因 16SrDNA序列序列生物膜形成实验生物膜形成实验DNA测序、测序、生物信息学分析生物信息学分析确定特征片段确定特征片段临床验证临床验证比较分析比较分析材料和方法材料和方法12 图图2.12.1：： 部分样品刚果红试验结果34 1、刚果红试验、刚果红试验第三部分第三部分 结果和讨结果和讨论论13 表2.1: 114例CoNS的菌种组成及刚果红试验结果菌菌 种种例数例数所占比例（％）所占比例（％）刚刚果果红试验红试验阳性阳性刚刚果果红试验红试验各菌种阳性各菌种阳性率（％）率（％）表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌4741.21838.3溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌4337.736.98人葡萄球菌人葡萄球菌119.6519.09木糖葡萄球菌木糖葡萄球菌32.630－－沃氏葡萄球菌沃氏葡萄球菌21.750－－头头状葡萄球菌状葡萄球菌32.63133.3中中间间葡萄球菌葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌山羊葡萄球菌21.750－－缓缓慢葡萄球菌慢葡萄球菌合合计计21141.75100024－－结果和讨论结果和讨论14 u刚果红试验通过培养刚果红试验通过培养48h后菌落的颜色变化来反映后菌落的颜色变化来反映 CoNS 表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。
致病性u114例样品中刚果红试验阳性率例样品中刚果红试验阳性率21.1%，由于，由于CoNS分泌分泌的的PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求正确性，不能满足临床要求 结果和讨论结果和讨论15 2、、ica D基因片段的扩增基因片段的扩增 a b c d e f g20001000500250(bp)图2.2 ：部分样品的icaD基因片段的 PCR 扩增结果结果和讨论结果和讨论16 表2.2: 114例CoNS不同菌种icaD片段PCR扩增的结果 菌菌 种种例数例数所占比例（％）所占比例（％） icaD片段片段PCR阳性阳性结结果果 PCR实验实验各菌种阳性率各菌种阳性率（％）（％）表皮葡萄球菌表皮葡萄球菌4741.22042.6溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌4337.7818.6人葡萄球菌人葡萄球菌119.65218.2木糖葡萄球菌木糖葡萄球菌32.630－－沃氏葡萄球菌沃氏葡萄球菌21.750－－头头状葡萄球菌状葡萄球菌32.6266.7中中间间葡萄球菌葡萄球菌10.861100山羊葡萄球菌山羊葡萄球菌21.750－－缓缓慢葡萄球菌慢葡萄球菌合合计计21141.75100033－－结果和讨论结果和讨论17 u通过设计通过设计icaD基因的特异性引物，对临床分离的基因的特异性引物，对临床分离的114 株株CoNS进行进行PCR 循环扩增，循环扩增，29%（（33/114）的菌株可以检）的菌株可以检测到测到357bp 的的icaD 基因产物；基因产物；u 表明大部分表明大部分 CoNS 不表达胞外多糖，无致病性，或者临不表达胞外多糖，无致病性，或者临床分离的绝大部分床分离的绝大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群可能是低毒性，源于正常菌群的污染。
的污染u采用采用 PCR 技术对技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，可操纵子结构基因片段进行扩增，可以准确、快速地鉴定以准确、快速地鉴定CoNS中致病性与非致病性的葡萄球中致病性与非致病性的葡萄球菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理治疗提供实验室依据，有重要的临床意义治疗提供实验室依据，有重要的临床意义 结果和讨论结果和讨论18 图2.3 : 部分样品的定性黏附性实验结果 3、体外黏附性实验、体外黏附性实验 结果和讨论结果和讨论19 表2.4 : 9例icaD（ + ）菌株半定量黏附性实验结果实验实验分分类类实验实验例数例数黏附黏附实验实验阳性阳性黏附黏附实验实验阴性阴性ica D PCR（＋），（＋），刚刚果果红红（＋）（＋）660ica D PCR（＋），（＋），刚刚果果红红（（—））321合计合计981 结果和讨论结果和讨论20 u通过体外半定量黏附实验测得通过体外半定量黏附实验测得88.9%（（8/9））icaD（（ + ）菌株是粘附株菌株是粘附株u可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力的判定标准，的判定标准，ica 操纵子的存在与操纵子的存在与CoNS粘附及其粘附及其生物膜形成密切相关。
生物膜形成密切相关u体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性，不适合临床常规应用好的重复性，不适合临床常规应用 结果和讨论结果和讨论21 4、、16S rDNA及及sodA基因片段扩增基因片段扩增 a b c d e 20001000500100(bp)图2.5：部分样品的16S rDNA片段 PCR扩增结果 结果和讨论结果和讨论22 图图2.6：： 部分样品的部分样品的sodA 片段片段PCR 扩增结果扩增结果 a b c d e 20001000500250(bp) 结果和讨论结果和讨论23 图7： 部分样品sodA PCR扩增产物的测序图谱 结果和讨论结果和讨论24 u 37例例CoNS样品进行了样品进行了16S rDNA基因及基因及sodA基因片段基因片段的的PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增出相应的片段，其片段大小分别为扩增出相应的片段，其片段大小分别为16S rDNA 926bp及及sodA 482bp，且均为单一条带；，且均为单一条带；u序列测定表明所有样品序列测定表明所有样品16S rDNA 及及sod A PCR产物产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。
序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列 结果和讨论结果和讨论25 uica操纵子可出现在多种操纵子可出现在多种CoNS中，临床实验室中，临床实验室建立并常规进行建立并常规进行CoNS致病性分子标志物的检致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的；测方法是有意义、有必要的；u通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的医院感染相关性医院感染相关性CoNS基因诊断新方法，即基因诊断新方法，即ica D基因扩增方法；基因扩增方法； 第四部分第四部分 结论结论26 结论结论u本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘附因子的情况；附因子的情况；u表皮葡萄球菌在临床表皮葡萄球菌在临床CoNS中检出最多，是携中检出最多，是携带带icaD操纵子的主要菌种，其致病性应引起操纵子的主要菌种，其致病性应引起足够重视；足够重视；27 结论结论u16S rDNA以及以及sod A基因可作为鉴定基因可作为鉴定CoNS的基因标记，但不能用来作为致病性与非的基因标记，但不能用来作为致病性与非致病性凝固酶阴性葡萄球菌的鉴别依据。
致病性凝固酶阴性葡萄球菌的鉴别依据u目前区分致病性与非致病性凝固酶阴性葡目前区分致病性与非致病性凝固酶阴性葡萄球菌的基因标志仍是串联存在的萄球菌的基因标志仍是串联存在的ica D基基因片段，其可被认为是获得性医院感染相因片段，其可被认为是获得性医院感染相关性关性CoNS特异的基因型或基因标志物特异的基因型或基因标志物28 29 。