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1、第二章第二章 植物组织培养实验室的组植物组织培养实验室的组 成、仪器设备及基本操作成、仪器设备及基本操作一、植物组织培养实验室的结构及设计要求一、植物组织培养实验室的结构及设计要求： 完整的植物组织培养室通常包括完整的植物组织培养室通常包括洗涤室、化学实验室、洗涤室、化学实验室、接种室、培养室、细胞学实验室接种室、培养室、细胞学实验室等部分。可以根据实际需等部分。可以根据实际需要和条件进行设计。要和条件进行设计。 但从功能上至少包括但从功能上至少包括准备室（化学实验室）、接种室准备室（化学实验室）、接种室以以及及培养室培养室三部分，并且按顺序排列。三部分，并且按顺序排列。 在化学实验室与接种在
2、化学实验室与接种室之间应留有缓冲空间。室之间应留有缓冲空间。第一节第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术实验室结构、仪器设备及操作技术（一）准备室（化学实验室）：（一）准备室（化学实验室）： 1. 主要功能主要功能： 用于培养器皿的清洗、干燥、培养基用于培养器皿的清洗、干燥、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作整理等工作。 2. 主要仪器设备及用品：主要仪器设备及用品： 药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤药品柜、实验台、水槽、超声波洗涤仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿仪、凉干架、干燥箱、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角（烧杯、量筒、容
3、量瓶、试剂瓶、三角瓶等）、蒸馏水制造装置。瓶等）、蒸馏水制造装置。 天平、移液器、天平、移液器、 pH计、水浴锅、微波计、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、及培养基分装用品等、高压灭菌锅、养基分装用品等、高压灭菌锅、 冰箱。冰箱。（二）接种室（无菌操作室）：（二）接种室（无菌操作室）： 1、功能：、功能： 接种材料的灭菌、接种以及培养物的接种材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。继代转接等。 接种室要求保持洁净，与化学实验室接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。之间应设置缓冲室。2、仪器设备及用品：、仪器设备及用品： 超净工作台、紫外灯、
4、小推车、搁架、超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。雾器、细菌过滤器等）等。（三）培养室：（三）培养室： 1、功能：功能： 主要用于植物材料的培养。主要用于植物材料的培养。 要求室内洁净并能保持一定的温度、要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度，以促进植物材料的生光照以及湿度，以促进植物材料的生长和分化。长和分化。2、仪器设备及用品：、仪器设备及用品： 培养架及灯管、摇床（振荡器）培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器
5、、加湿及除湿、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱等。器、光照培养箱等。（四）细胞学实验室：（四）细胞学实验室： 1、功能：、功能： 主要用于培养材料的显微观察及主要用于培养材料的显微观察及照相等照相等。2、仪式设备及用品：、仪式设备及用品： 体视显微镜、普通显微镜、倒体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套制片及染色用机、切片机及配套制片及染色用品等品等。体视显微镜体视显微镜用途：放大倍数用途：放大倍数580倍主要用于植物形态倍主要用于植物形态分化的观察、茎尖的分化的观察、
6、茎尖的切取。切取。普通光学显微镜普通光学显微镜用途：用于植物切用途：用于植物切片观察，确定植物片观察，确定植物的发育进程，如：的发育进程，如：不定芽、不定胚的不定芽、不定胚的分化过程以及其它分化过程以及其它器官组织的分化等。器官组织的分化等。倒置显微镜倒置显微镜用途：主要用于细用途：主要用于细胞、原生质体的细胞、原生质体的细胞分裂和细胞团形胞分裂和细胞团形成的观察。成的观察。（一）洗涤：（一）洗涤： 1. 普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。性洗涤剂洗涤。 2. 难清洗器皿及移液管等：用水清洗后难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后
7、清水冲洗，再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。或用超声波仪清洗。 重铬酸钾洗液的配制方法：重铬酸钾洗液的配制方法：43g重铬酸钾溶于重铬酸钾溶于1000ml蒸馏水中，将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾蒸馏水中，将浓硫酸缓慢倒入重铬酸钾溶液中，浓度比例为溶液中，浓度比例为1：1。二、实验室基本操作：二、实验室基本操作： 1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。 （1）干热灭菌：）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，内，150 保温保温2小时，成本较高。小时，成本较高。 （2）高压蒸汽灭菌：）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌
8、锅内高压蒸汽灭菌锅内120 15152020分钟分钟 。 （3）灼烧灭菌：）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入接种时，解剖刀及镊子等浸入95乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。（二）灭菌：（二）灭菌： 灭菌灭菌 是是指用物理和化学方法杀死物体表面和内指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物部的所有微生物（包括芽胞）（包括芽胞），使之呈无菌状态。，使之呈无菌状态。经过灭菌的物品称经过灭菌的物品称“无菌物品无菌物品”。2、培养基灭菌：、培养基灭菌： 采用高压蒸汽灭菌。采用高压蒸汽灭菌。120 1520分分钟。钟。 培养基体积越大，灭菌时间越长。培养
9、基体积越大，灭菌时间越长。高温高压灭菌对培养基成分的影响：高温高压灭菌对培养基成分的影响：值普遍下降。值普遍下降。b.b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如生化学反应而产生混浊或沉淀。例如CaCa+2+2与与POPO4 4-3-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。化合，就会产生磷酸钙沉淀。c.c.不少培养基颜色加深。不少培养基颜色加深。d.d.体积和浓度有所变化。体积和浓度有所变化。e.e.营养成分有时受到破坏。营养成分有时受到破坏。3、不耐高温材料的灭菌：、不耐高温材料的灭菌： 采用过滤灭菌，如采用过滤灭菌，如IAA、ZT、天
10、然有机、天然有机添加物等。添加物等。4、外植体的表面灭菌：、外植体的表面灭菌： 采用采用7075乙醇（乙醇（10-30秒）、有效秒）、有效氯氯1的次氯酸钠（的次氯酸钠（5-30分钟）、分钟）、0.2%的氯化汞（的氯化汞（2-15分钟）等杀菌剂中加入几分钟）等杀菌剂中加入几滴吐温滴吐温20或或80（Tween20或或80）效果）效果较好。较好。（三）无菌操作：（三）无菌操作： 1、保持接种室的无污染环境保持接种室的无污染环境，定期熏蒸，定期熏蒸或喷雾处理。接种前打开超净工作台及紫或喷雾处理。接种前打开超净工作台及紫外灯照射外灯照射20-30分钟，关闭紫外等灯后使气分钟，关闭紫外等灯后使气体散出后
11、开始操作。体散出后开始操作。 2、保持超净工作台的洁净：保持超净工作台的洁净：接种前用接种前用70乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用将手和手臂用70乙醇消毒，所需试验用乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。品用乙醇擦拭后放入超净工作台。3、点燃酒精灯，进行操作，、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前接种材料前后，灼烧瓶口，后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交工具要灼烧彻底，防止交叉污染。叉污染。4、保持培养室的洁净，发现污染及时挑保持培养室的洁净，发现污染及时挑出，出，以减少污染源。以减少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，操作中穿
12、工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。第二章第二章 植物组织培养实验室的组成、植物组织培养实验室的组成、仪器设备及基本操作仪器设备及基本操作第一节第一节 实验室结构、仪器设备及操作技术实验室结构、仪器设备及操作技术 一、植物组织培养实验室的结构及设计要求一、植物组织培养实验室的结构及设计要求 二、二、 实验室基本操作实验室基本操作第二章第二章 植物组织培养实验室的组植物组织培养实验室的组 成、仪器设备及基本操作成、仪器设备及基本操作第二节第二节 培养基的组成、配制与灭菌培养基的组成、配制与灭菌一、培养基（一、培养基（mediummedi
13、um）的组成和作用）的组成和作用 通常植物组织培养所用培养基包括以下六大通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即类成分，即矿质营养、有机成分、植物生矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。等。培养基的主要指标是培养基的主要指标是: : 营养成分的浓度营养成分的浓度 植物生长调节物质的浓度植物生长调节物质的浓度（一）矿质营养：（一）矿质营养： 矿质营养又称无机营养，是指植物生矿质营养又称无机营养，是指植物生长发育所需要的各种化学元素。长发育所需要的各种化学元素。 矿质元素的生理作用：矿质元素的生理作用：（1 1）组成各种化合物，成
14、为结构物质；）组成各种化合物，成为结构物质；（2 2）许多酶和附酶的组成部分，参与）许多酶和附酶的组成部分，参与代谢；代谢；（3 3）维持离子平衡、胶体稳定及电荷）维持离子平衡、胶体稳定及电荷平衡等电化学作用；平衡等电化学作用；（4 4）影响形态发生和组织、器官的建）影响形态发生和组织、器官的建成等。成等。 根据植物对元素的吸收量，可以把植物必根据植物对元素的吸收量，可以把植物必需元素分为大量元素和微量元素。需元素分为大量元素和微量元素。 国际植物生理学会规定植物所需浓度大于国际植物生理学会规定植物所需浓度大于0.5 0.5 mmol/lmmol/l的的元素称为大量元素。低于的的元素称为大量元
15、素。低于0.5 mmol/l0.5 mmol/l的元的元素称为微量元素。素称为微量元素。 大量元素：大量元素：C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S 分别占植物干重的百分数为分别占植物干重的百分数为1818、1010、7070、0.3%0.3%、0.3%0.3%、0.3 0.3 、0.07%0.07%、。、。 微量元素：微量元素：FeFe、B B、MnMn、ZnZn、MoMo、CuCu、CoCo、ClCl等等。1 1、大量元素：、大量元素： N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等等6 6种大量元素依靠各种无机种大量元素依靠各种无机盐提供。盐提供
16、。 不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同植物种类和不同试验目的对元素的使用量要求不同，需经试验确定。不同，需经试验确定。 目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。目前已选择出多种培养基配方用于植物组织培养。其中以其中以MSMS应用最广泛。应用最广泛。 以以MSMS为例为例6 6中矿质元素分别由中矿质元素分别由KNOKNO3 3、NHNH4 4NONO3 3、KHKH2 2POPO4 4、MgSOMgSO4 47H7H2 2O O、CaClCaCl2 24H4H2 2O O提供。提供。 大量元素中的氮通常采用硝态氮大量元素中的氮通常采用硝态氮或铵态氮，但铵态氮浓度过高会对或铵态氮
17、，但铵态氮浓度过高会对有些植物的培养物造成伤害，不适有些植物的培养物造成伤害，不适宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、宜使用过高的浓度，可以用谷氨酸、丝氨酸等来代替。丝氨酸等来代替。2 2、微量元素：、微量元素： 植物组织的对其需要量极少，过多会产生植物组织的对其需要量极少，过多会产生毒害，如造成蛋白质变性、酶失活毒害，如造成蛋白质变性、酶失活, ,代谢障碍代谢障碍等。等。 各种微量元素均具有特定的生理功能，如各种微量元素均具有特定的生理功能，如硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能硼与蛋白质的合成及糖类的运输有关；铜能促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用促进离体根的形成；锰参与植物的光合作用和
18、呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。和呼吸作用；钼为氮素代谢的重要元素。 微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿微量元素中，铁的用量较大，它对叶绿素的合成起重要作用，由于在较高素的合成起重要作用，由于在较高pHpH下，下，FeClFeCl3 3极易形成极易形成FeFe（OHOH）3 3沉淀，难以被吸沉淀，难以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫收，所以多用乙二胺四乙酸二钠盐与硫酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。酸亚铁形成的螯合物，并且单独配制。（二）有机成分：（二）有机成分： 主要包括各种主要包括各种维生素和氨基酸维生素和氨基酸 常用的维生素：硫胺素（常用的维生素：硫胺素（V VB1B1）、吡哆醇
19、（）、吡哆醇（V VB6B6）、烟酸）、烟酸（V VB3B3）、泛酸钙（）、泛酸钙（V VB5B5）、生物素、钴胺素（）、生物素、钴胺素（V VB12B12）、叶酸等。）、叶酸等。 常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精常用的氨基酸：甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。 有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工有时添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，为牛乳经酶法加工的水解产物，含有的水解产物，含有2020种氨基酸的混合物，用量种氨基酸的混合物，用量10101000mg/L, 1000mg/L, 通常用于原生质体
20、等培养。通常用于原生质体等培养。 此外此外肌醇肌醇是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡，是另外一种重要的有机成分，在维持离子平衡，糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理作糖类的转化中起重要作用，此外还参与磷脂代谢及等生理作用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化。用。它可以促进愈伤组织的形成，不定芽、不定胚的分化。（三）植物生长调节物质：（三）植物生长调节物质： 植物激素是植物代谢中产生的天然化合物，它植物激素是植物代谢中产生的天然化合物，它能直接影响植物细胞的分化、分裂以及影响植物的能直接影响植物细胞的分化、分裂以及影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休
21、眠、形态建成、开花、结实、成熟、衰老脱落、休眠、萌发等生理活动。萌发等生理活动。 在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长在植物组织培养中，主要通过植物激素及生长调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。调节物质对离体的组织、器官的形态发生进行调控。包括诱导包括诱导细胞分裂、愈伤组织的生长、根细胞分裂、愈伤组织的生长、根芽的分化以及体细胞胚胎发生等。芽的分化以及体细胞胚胎发生等。 常用的植物激素及生长调节物涉及五大常用的植物激素及生长调节物涉及五大类植物激素：类植物激素：1 1、生长素类：、生长素类：2 2、细胞分裂类：、细胞分裂类：3 3、赤霉素类：、赤霉素类：4 4、脱落酸：、脱落酸：
22、5 5、多胺、多胺6 6、乙烯：、乙烯：1 1、生长素类：、生长素类： 组织培养中的功能是：促进细胞伸长组织培养中的功能是：促进细胞伸长生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，生长和细胞分裂，诱导形成愈伤组织，促进生根。促进生根。 常用的有常用的有NAANAA、IAAIAA、IBAIBA、2,42,4D D等。等。2 2、细胞分裂素类：、细胞分裂素类： 功能：诱导芽的分化、促进侧芽功能：诱导芽的分化、促进侧芽萌发；促进细胞分裂和扩大，促进茎萌发；促进细胞分裂和扩大，促进茎增粗，抑制茎伸长；延缓衰老。增粗，抑制茎伸长；延缓衰老。 常用细胞分裂素有常用细胞分裂素有BABA、KTKT、ZTZT、2ip2i
23、p等。等。 此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常此外近年来发现苯基脲衍生物具有非常高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。高的细胞分裂素活性，在多种植物上应用。 如如TDZTDZ，CPPUCPPU，4 4PUPU等。等。3 3、赤霉素类：、赤霉素类： 主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无主要具有诱导茎的细胞伸长，对根无效；对形成层细胞分化有影响，与生长效；对形成层细胞分化有影响，与生长素协同作用；可以诱导离体成花；素协同作用；可以诱导离体成花；打破打破休眠休眠等功能。等功能。 常用常用GAGA3 3、GAGA4 4等等。4 4、脱落酸（、脱落酸（ABAABA）：）： 促进休眠、衰老和脱落。组促进休眠、
24、衰老和脱落。组织培养中较少使用，主要用于织培养中较少使用，主要用于种质资源的离体保存种质资源的离体保存。5 5、乙烯：、乙烯： 主要促进衰老和脱落，高浓度易形态主要促进衰老和脱落，高浓度易形态变化。变化。（四）碳源：（四）碳源： 碳源主要为细胞提供合成新化合碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透物与能源，此外还能维持一定的渗透压。压。 常用的碳源主要是蔗糖，使用浓常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在度在101050g/L50g/L，此外果糖、葡萄糖、，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀麦芽糖、山梨
25、糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。粉等也常用于植物组织培养。（五）琼脂：（五）琼脂： 琼脂作为固化剂用于组织培养琼脂作为固化剂用于组织培养中，起支持植物的作用，不提供营中，起支持植物的作用，不提供营养，为海藻中提取的一种高分子化养，为海藻中提取的一种高分子化合物，仅溶于热水（合物，仅溶于热水（90 90 o oC C以上），以上），成为凝胶，冷却后（成为凝胶，冷却后（40 40 o oC C以下）以下）即凝固为凝胶。即凝固为凝胶。 琼脂的用量通常在琼脂的用量通常在4 410g/L10g/L。 （六）有机附加物：（六）有机附加物： 1 1、椰子汁：、椰子汁： 用量为用量为100100
26、200g/L200g/L。 2 2、香蕉泥：、香蕉泥： 使用量为使用量为150150200g/L200g/L。 3 3、苹果汁、番茄汁等。、苹果汁、番茄汁等。（七）其他成分：（七）其他成分： 1 1、活性炭：使用量为、活性炭：使用量为0 .2-1%0 .2-1%。 2 2、抗生素：常用青霉素、链霉素、抗生素：常用青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在庆大霉素等，用量在5 520mg/L20mg/L。 3 3、抑制酚类物质：抗坏血酸、抑制酚类物质：抗坏血酸. . 4 4、生长抑制剂：、生长抑制剂： 常用矮壮素、比久（常用矮壮素、比久（B9B9）、多效唑）、多效唑（pp333pp333） 、三碘苯甲酸
27、、根皮酚等、三碘苯甲酸、根皮酚等. .二、培养基的类型：二、培养基的类型：1 1、高盐浓度培养基：高盐浓度培养基：MSMS、B5B5、SHSH等。等。 适用于多数营养需求量较大的植物。适用于多数营养需求量较大的植物。2 2、低盐培养基：低盐培养基：WPMWPM、 White White、 Nitsh Nitsh等。等。 适用于木本植物的培养。适用于木本植物的培养。表表1MS培养基的组成配方培养基的组成配方组成成分组成成分数量数量(mg/l)组成成分组成成分数量数量(mg/l)NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 44
28、0 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇肌醇 100.0 H3BO36.2 烟酸烟酸 0.5 MnSO44H2O22.3 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 盐酸硫铵等盐酸硫铵等 0.4 CoCl26H2O0.025 表表2 2B B5 5培养基的组成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(mg/l） 组成成分组成成分 数量数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150
29、CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇肌醇 100 H3BO4 3.0 烟酸烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 盐酸硫铵盐酸硫铵 10 Na2-EDTA37.3 表表3 N6培养基的组成和配方培养基的组成和配方组成成分组成成分 数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22
30、H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185 蔗糖蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O1.5 三、培养基母液及激素母液的配制：三、培养基母液及激素母液的配制： 由于培养基中元素用量少，种类多，因由于培养基中元素用量少，种类多，因此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分此每次称量繁琐，因此通常将各种营养成分配制成母液保存。配制成母液保存。 大量元素大量元素
31、微量元素微量元素 有机营养有机营养 激素激素 1、器皿和用具的准备、器皿和用具的准备 仪器包括万分之一天平，百分之一天平，仪器包括万分之一天平，百分之一天平，pH计计 用品包括不同型号的烧杯（用品包括不同型号的烧杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移）、移液管（液管（10ml、5ml、2ml、1ml）、试剂瓶若干）、试剂瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（）、移液器（1000ul、200ul）、）、滴管、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（滴管、玻璃棒、试管、各种规格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培养基分装器
32、，漏斗、称量纸、标）、培养基分装器，漏斗、称量纸、标签纸、不同范围签纸、不同范围pH试纸、铅笔等。试纸、铅笔等。 玻璃器皿用前清洗干净。玻璃器皿用前清洗干净。 2、药品及蒸馏水准备：、药品及蒸馏水准备： 药品采用分析纯或化学纯试剂。药品采用分析纯或化学纯试剂。 水利用蒸馏水或去离子水。水利用蒸馏水或去离子水。3、母液配制：、母液配制： （1）配制母液原则：）配制母液原则： 相同类型的试剂混合；相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；用量要认真计算和核对； 药品要准确称量。药品要准确称量。 （2）MS培养基母液的配制：
33、培养基母液的配制： MS培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，培养基母液根据试剂特性通常配成四种母液，即即大量元素母液大量元素母液（10或或20倍）、倍）、微量元素母液微量元素母液（100或或1000倍）、倍）、Fe盐盐（100倍）、倍）、有机物有机物（100倍）。倍）。 配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母配置前先进行根据培养基组成和配制体积计算母液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分液试剂用量，然后称取药品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用之一或千分之一天平，微量元素，铁盐和有机物用万分之一天平称量。万分之一天平称量。（3）激素母液的配制：）激素
34、母液的配制： 根据各种激素的使用浓度配制适宜的母根据各种激素的使用浓度配制适宜的母液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解液，用万分之一天平称取激素，溶剂溶解后加水定容。后加水定容。 生长素类、赤霉素类及脱落酸等用生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95乙醇溶解；细胞分裂素类用乙醇溶解；细胞分裂素类用1N HCl或或1N NaOH溶解。溶解。 通常激素母液浓度生长素类为通常激素母液浓度生长素类为0.10.5 mg/ml, 细胞分裂素母液浓度为细胞分裂素母液浓度为0.21.0 mg/ml.四、培养基的配制：四、培养基的配制： 1.量取母液：营养元素和激素。量取母液：营养元素和激素。2.称量蔗糖、琼脂，放入
35、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。3.加入母液，混合均匀，调整加入母液，混合均匀，调整pH值。值。四、培养基的配制：四、培养基的配制： 1.量取母液：营养元素和激素。量取母液：营养元素和激素。2.称量蔗糖、琼脂，放入称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。3.加入母液，混合均匀，调整加入母液，混合均匀，调整pH值。值。封口：用封口：用46层称量纸或瓶盖封口，之后层称量纸或瓶盖封口，之后灭菌备用。灭菌备用。分装入瓶，每瓶分装入瓶，每瓶4050m
36、l。五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：1、加热、加热： 灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。闭放气阀，打开电源，加热升温。2、排气、排气： 当温度升至当温度升至0.5kg/cm(100 0C)时，打开时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。气阀，促使压力继续上升。3、温度控制：、温度控制： 当锅内压力升至当锅内压力升至2(121oC)时，计时时，计时1520分钟，计时结束后，关闭电源。分钟，计时结束后，关闭电源。4、出锅：、出锅： 当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。于接种室备用。
