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1、 生物素生物素- -亲合素放大技合素放大技术.第二第二节 亲合素、合素、链霉霉亲合素的理化性合素的理化性质与与标记一、理化特性一、理化特性二、二、亲合素（或合素（或链酶亲合素）的合素）的标记第一第一节 生物素的理化性生物素的理化性质与与标记一、活化生物素一、活化生物素二、活化生物素二、活化生物素标记蛋白蛋白质.第三第三节 生物素生物素- -亲合素系合素系统的特点的特点一、灵敏度二、特异性一、灵敏度二、特异性三、三、稳定性四、适用性定性四、适用性五、其他五、其他思考思考题小小结第四第四节 生物素生物素- -亲合素系合素系统的的应用用一、生物素一、生物素- -亲合素系合素系统基本基本类型及原理型及
2、原理二、生物素二、生物素- -亲合素系合素系统在在酶免疫免疫测定中的定中的应用用三、生物素三、生物素- -亲合素系合素系统在在荧光免疫技光免疫技术中的中的应用用四、生物素四、生物素- -亲合素系合素系统在放射免疫在放射免疫测定中的定中的应用用五、生物素五、生物素- -亲合素系合素系统在分子生物学中的在分子生物学中的应用用.生物素（生物素（biotinbiotin）、）、亲和素和素（avidinavidin）是一）是一对具有高度具有高度亲和力的物和力的物质，结合迅速、合迅速、专一、一、稳定并具有多定并具有多级放大效放大效应。BABBAABC.生物素（生物素（维生素生素H H） 动、植物、植物组织
3、中广泛中广泛 分布分布, ,卵黄和肝含量高卵黄和肝含量高分子量小，分子量小，244.31 D244.31 DI I环为咪咪唑酮环，可与，可与亲合合 素素结合合环为噻吩吩环，C2C2上戊酸上戊酸侧链的未端的未端羧基是基是结合生物大合生物大分子的唯一分子的唯一结构构 I I I I 咪咪咪咪唑酮环唑酮环 噻噻吩吩吩吩环环 羧基基: :可用于活化可用于活化为其他衍其他衍生物生物第一第一节 生物素理化性生物素理化性质与与标记.一、活化生物素一、活化生物素 生物素生物素侧链的末的末端端羧基基经化学修化学修饰后制成后制成带各种各种活性基活性基团的衍生的衍生物物活化生物素活化生物素( (生物素化衍生物生物素
4、化衍生物) )为何要活化？何要活化？.活化生物素活化生物素活化生物素易活化生物素易与抗原、抗体、与抗原、抗体、酶及核酸分子及核酸分子中相中相应基基团偶偶联形成生物素形成生物素化化标记物物 标记蛋白蛋白质氨基氨基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白蛋白质醛基基的活化生物素的活化生物素 标记蛋白蛋白质巯基基的活化生物素的活化生物素 标记核酸核酸的活化生物素的活化生物素 .活化生物素活化生物素标记蛋白蛋白质氨基的活化生物素氨基的活化生物素BNHSBNHS分子可与蛋白分子可与蛋白质 赖氨酸氨酸（碱性（碱性AAAA）的氨基形成的氨基形成肽键 BNHSBNHS适用适用标记抗体和抗体和 中性或偏碱性中性或偏碱
5、性的蛋白的蛋白质生物素生物素N-N-羟基丁二基丁二酰胺胺碳二碳二亚胺胺生物素生物素羟基琥珀基琥珀酰亚胺胺酯(BNHS)(BNHS).如何减小空如何减小空间位阻位阻长臂活化生物素臂活化生物素（BCNHSBCNHS）：）：生物素和生物素和N-N-羟基丁二基丁二酰亚胺之胺之间添加了两个添加了两个6-6-氨基已糖分子基氨基已糖分子基团，形成，形成连结臂，生物素臂，生物素与大分子基与大分子基团的距离增加，更易的距离增加，更易发挥生物素生物素的活性作用。的活性作用。生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰。？.标
6、记蛋白蛋白质醛基的活化生物素基的活化生物素生物素生物素酰肼(BHZ)(BHZ)：水合水合肼与生物素的合成物与生物素的合成物 主要用于主要用于标记偏酸性偏酸性糖蛋白糖蛋白 肼化生物胞素化生物胞素(BCHZ)(BCHZ) ：生物素与：生物素与赖氨酸氨酸连接后，接后， 再与无水再与无水肼反反应而成。而成。 除除醛基外，基外， BCHZBCHZ还可可标记氨基氨基.标记蛋白蛋白质巯基的活化生物素基的活化生物素马来来酰亚胺胺- -丙丙酰- -生物胞素（生物胞素（MPB)MPB)：能特异地与蛋白能特异地与蛋白质巯基基结合的活化生物素合的活化生物素 .标记核酸的活化生物素核酸的活化生物素光生物素光生物素(ph
7、otobiotin)(photobiotin)光敏物光敏物质 侧链上上连接的接的芳香基叠氮物基芳香基叠氮物基团, , 经光照后光照后, , 变为芳香基硝芳香基硝基苯，可直接与腺基苯，可直接与腺嘌呤氨基呤氨基结合合, , 形成形成B-B-核酸探核酸探针，用于，用于DNADNA或或RNARNA的的标记。 生物素脱氧核苷三磷酸（如生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTPBio-dUTP） 作作为TTPTTP的的结构构类似物，可采用缺口移位法（似物，可采用缺口移位法（DNase IDNase I和和DNADNA聚聚合合酶I I）掺入到双入到双链DNADNA中。中。BNHSBNHS和和BHZBHZ 可直
8、接可直接标记核酸，但核酸，但对碱基配碱基配对有影响。有影响。目前常用光生物素和生物素化目前常用光生物素和生物素化dUTPdUTP作作为标记核酸的活化生物素。核酸的活化生物素。.特性：特性：活化生物素通活化生物素通过侧链与蛋白分子与蛋白分子连接；接；一个蛋白分子可被多个生物素一个蛋白分子可被多个生物素标记多价性（是多价性（是BAS多多级放大放大作用的物作用的物质基基础）；）；BNHS多多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白抗体和中性或偏碱性的蛋白质, BHZ则多多标记微微酸性抗原；抗原、抗体酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不后活性不变；可可对标记材料（如材料（如酶）标记：碱性磷酸：碱性磷酸酶标记后，活性降
9、低；后，活性降低；二、活化生物素二、活化生物素标记蛋白蛋白质.注意事注意事项：选择活化生物素：活化生物素：依抗原或抗体分子所依抗原或抗体分子所带可可标记基基团 的种的种类（氨基、（氨基、醛基或基或巯基）以及分子的酸碱性；基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白控制生物素：蛋白质比例比例 生物素：生物素：IgG IgG 用量比用量比(mg/mg)宜宜为2:1, IgG2:1, IgG应用用浓度度 0.50.55 5g/ml; 生物素生物素1 13 3个个/Ag/Ag，3 35 5个个/Ab/Ab；使用交使用交联臂减少空臂减少空间阻力阻力.第二第二节 亲合素、合素、链霉霉亲合素的理合素的理化性化性质
10、与与标记亲合素合素(avidin, AV) 和和链霉霉亲合素合素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性是生物素的天然特异性结合合物。而且，物。而且，二者均二者均为大分子蛋白大分子蛋白，因此几乎所，因此几乎所有用于有用于标记的物的物质均可以同均可以同亲合素（合素（AV）或）或链酶亲合素（合素（SA）结合合。 .结构构 四四亚基糖蛋白基糖蛋白 四四肽链蛋白蛋白 无糖基无糖基PI PI 10.5 610.5 6结合位合位 色氨酸色氨酸 色氨酸色氨酸生物素生物素 4 44 4Ka Ka 10 1015 15 10 101515活性活性 131315U 1515U 1518U18U亲亲
11、合素（合素（合素（合素（AVAVAVAV）链链霉霉霉霉亲亲合素合素合素合素(SA)(SA)(SA)(SA)一、理一、理 化化 特特 性性SASA表面所表面所带正正电荷少，且不含糖基，非特异性荷少，且不含糖基，非特异性结合合远低于低于AVAV，因此目前以，因此目前以SASA标记的的酶结合物更合物更为常用。常用。.二、二、亲合素合素/链霉霉亲合素的合素的标记v可可标记AV/SAAV/SA的物的物质：酶、抗原或抗体、抗原或抗体、铁蛋白、蛋白、 胶体金、胶体金、125125I I、异硫、异硫氰酸酸荧光素（光素（FITCFITC）等。）等。 vHRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接蛋白的直接标记法）：法
12、）： 过碘酸碘酸钠法、戊二法、戊二醛法。法。vABC/SABC ：通通过与生物素化与生物素化酶复合物中的复合物中的 生物素生物素结合，合，间接地与接地与酶形成形成结合物。合物。 AV(SA)+B-HRP/ALP ABC(avidin-biotin-peroxidase comlplex) /ABAP .第三第三节 生物素生物素- -亲合素系合素系统(BAS)(BAS)的特点的特点灵敏度高灵敏度高: :生物素生物素标记蛋白具有多价性，且蛋白具有多价性，且标记后的抗原后的抗原/ /抗体生物活性不抗体生物活性不变，每个，每个亲合素有四个生物素合素有四个生物素结合部位，可同合部位，可同时以多价形式以多
13、价形式结合到生物素化大分子衍生物和合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此，志物上，因此，BASBAS具有多具有多级放大作用，反放大作用，反应的灵敏度高。的灵敏度高。稳定性高和特异性定性高和特异性强：AV/SAAV/SA与生物素与生物素结合的合的亲和常数比抗原和常数比抗原- -抗体反抗体反应至少高至少高1 1万倍，二者的万倍，二者的结合呈高度合呈高度专一一性和不可逆性，且酸、碱、性和不可逆性，且酸、碱、变性性剂、蛋白溶解、蛋白溶解酶、有机溶、有机溶剂以以及反及反应试剂的高度稀的高度稀释均不影响其均不影响其结合。因此，合。因此，BASBAS稳定性高，定性高，特异性特异性强。.第三第三节 生物素生
14、物素- -亲合素系合素系统(BAS)(BAS)的特点的特点适用性广泛：适用性广泛：BAS的多的多级放大作用，以及既可放大作用，以及既可 偶偶联生物大分子，又可生物大分子，又可连接接标记材料，使材料，使BAS不不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位及定位观察研究，亦可制成察研究，亦可制成亲和介和介质用于上述各用于上述各 类反反应体系中反体系中反应物的分离、物的分离、纯化。化。其他：其他：可制成通用可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；（如生物素化二抗等）； 反反应试剂可高度稀可高度稀释，特，特别是与一抗偶是与一抗偶联使用可使用可 大幅减少一抗用量
15、，降低大幅减少一抗用量，降低实验成本；成本；实验所需所需时 间不不长。.第四第四节 生物素生物素- -亲合素系合素系统的的应用用生物素与生物素与亲合素之合素之间结合的合的亲合合力高、特异性力高、特异性强，各自均可以与各型，各自均可以与各型大小分子大小分子结合，以及二者在合，以及二者在结合反合反应时具有的多具有的多级放大作用等放大作用等优越性，使越性，使BASBAS及其相关技及其相关技术被广泛被广泛应用在各种用在各种标记免疫分析技免疫分析技术领域中，尤其域中，尤其为标记免疫免疫检测自自动化分析化分析做出了极大的做出了极大的贡献。献。 .一、生物素一、生物素- -亲合素系合素系统基本基本类型型及原
16、理及原理BABBAB法：法： Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A/SAA/SA Ag-Ab Ag-AbB-B-A/SA A/SA B BE E Ag-Ab Ag-AbB-A/SA-BB-A/SA-BE E 特点：以游离特点：以游离A/SAA/SA分分别连接接B-AbB-Ab和和B-E B-E .BABA法，也称法，也称标记亲合素合素- -生物素法生物素法: : （labeled avidin-biotin,LABlabeled avidin-biotin,LAB）Ag+BAg+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B A AE/SAE/SAE E Ag-AbAg-AbB
17、-A/SAB-A/SAE E特点：以特点：以A AE/SAE/SAE E代替代替BABBAB法中的法中的A/SAA/SA，省却了加，省却了加B BE E的步的步骤.3. 3. ABC ABC法法 A+BA+BE A- BE A- BE-ABCE-ABC Ag+B Ag+BAb Ag-AbAb Ag-AbB B ABCABC Ag-Ab Ag-AbB-ABC B-ABC 特点特点: :将将BABBAB法中的法中的A A先与先与B-EB-E结合，制合，制备成复合物成复合物 ABC,ABC,网网络了大量了大量酶分子，使分子，使该法的法的检测灵敏灵敏 度度显著提高。著提高。.BABBAABCBAB与A
18、BC成员相同，反应顺序不同.此外，按待此外，按待检反反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，BASBAS分分为直接法和直接法和间接法。接法。 方 法 反应层次 直接法 BA Ag-(Ab-B)-A* BAB Ag-(Ab-B)-A-B* ABC Ag-(Ab-B)-A-B*C 间接法 BA Ag-Ab1-(Ab2-B)-A* BAB Ag-Ab1-(Ab2-B)- A-B* ABC Ag-Ab1-(Ab2-B)- A-B*CBAS实验方法及反应层次.二、生物素二、生物素- -亲合素系合素系统在在酶免疫免疫测定中的定中的应用用BAS
19、BAS在在ELISAELISA中的中的应用用 ： BASBAS用于固相化抗原用于固相化抗原/ /抗体的制抗体的制备 AV/SAAV/SA先包被固相先包被固相载体、抗原体、抗原/ /抗体抗体 先与生物素先与生物素结合合 AV/SA-BAV/SA-B反反应而使抗原而使抗原/ /抗体固相化。抗体固相化。 BASBAS用于用于ELISAELISA的的终反反应放大放大 BA-ELISABA-ELISA、BAB-ELISABAB-ELISA、ABC-ELISAABC-ELISABASBAS在均相在均相酶免疫免疫测定中的定中的应用：用： B BE E* * A A-B A A-BE E（酶因活性中心受空因活
20、性中心受空间位阻作用而失活）位阻作用而失活） 反反应系系统： B BE E* * 、AgAgA A、AbAb（限量）、（限量）、标准准Ag/Ag/待待检AgAgAgAgA A和待和待检AgAg竞争争结合限量合限量AbAb，若，若Ag AgAg Ag Ab Ag Ab AgA AgA AgA-A-B BE E 酶活性活性变化与待化与待测标本中抗原本中抗原浓度呈度呈负剂量相关。量相关。 （酶活性降低）活性降低） .三、生物素三、生物素- -亲合素系合素系统在在荧光免光免疫技疫技术中的中的应用用 BAS BAS用于用于荧光抗体技光抗体技术可明可明显提高方法的灵敏度提高方法的灵敏度和特异性，通常采用和
21、特异性，通常采用BABA法，即用法，即用荧光素直接光素直接标记亲合素（或合素（或链酶亲合素）；也可采用游离合素）；也可采用游离亲合素（或合素（或链酶亲合素）搭合素）搭桥，两端分，两端分别连接生接生物素化抗体和物素化抗体和荧光素光素标记的生物素（的生物素（BABBAB法）法）或或荧光光标记的抗的抗亲合素（或合素（或链酶亲合素）抗体合素）抗体的的夹心法。心法。 BASBAS用于用于时间分辨分辨荧光免疫分析也可以将反光免疫分析也可以将反应信信号放大。号放大。.四、生物素四、生物素- -亲合素系合素系统在放射免在放射免疫疫测定中的定中的应用用BASBAS主要与免疫放射分析主要与免疫放射分析(IRMA)
22、(IRMA)检测体系偶体系偶联，用于，用于对终反反应的放大（的放大（BABA法）法） BASBAS也可用于也可用于IRMAIRMA反反应后后B B、F F成分的分离成分的分离 .五、生物素五、生物素- -亲合素系合素系统在分子生在分子生物学中的物学中的应用用以生物素以生物素标记核酸探核酸探针进行的定位行的定位检测用用BAS制制备的的亲和吸附和吸附剂进行基因的分离行基因的分离纯化化将免疫将免疫测定技定技术与与PCR结合建立合建立免疫免疫-PCR (immuno-PCR)用于抗原的用于抗原的检测 如如DNADNAB-B-SASAProAProA-IgG-IgG-Ag, Ag, AgAg和和DNAD
23、NA间建立建立对应关系，从而将关系，从而将对蛋白蛋白质的的检测转化化为对核酸的核酸的检测，抗原抗体反，抗原抗体反应的特异性与的特异性与PCRPCR技技术的高度敏感的高度敏感性相性相结合，其合，其检测灵敏度可达灵敏度可达1010-21-21molmol水平，水平，是迄今最敏感的分析方法是迄今最敏感的分析方法。.思考思考题1.1.生物素的分子生物素的分子结构特点是什么？构特点是什么？2.2.生物素通生物素通过什么什么结构、形式与生物大分子相构、形式与生物大分子相连结？3.3.亲合素或合素或链霉霉亲合素的分子合素的分子结构、理化性构、理化性质有何特点？有何特点？4.4.为什么什么亲合素、合素、链霉霉
24、亲合素具有合素具有“桥联”作用？作用？5.5.亲合素、合素、链霉霉亲合素可以被哪些示踪合素可以被哪些示踪剂标记？6.6.为什么生物素什么生物素亲合素系合素系统具有放大作用？具有放大作用？7.7.生物素与生物素与亲合素或合素或链霉霉亲合素的合素的结合是否与抗原抗体合是否与抗原抗体结合相同？合相同？8.8.生物素生物素亲合素系合素系统放大的是反放大的是反应过程程还是是单一一检测信号？信号？9.9.生物素、生物素、亲合素或合素或链霉霉亲合素如何与合素如何与标记免疫技免疫技术联接？接？10.10.如何将生物素如何将生物素链霉霉亲合素放大系合素放大系统用于所有双位点用于所有双位点ELISA?ELISA?
25、.小小 结v生生物物素素亲合合素素（链霉霉亲合合素素）系系统具具有有的的多多级放放大大独独特特效效应，可可极极大大地地提提高高分分析析测定定的的灵灵敏敏度度；二二者者之之间的的高高亲和和、高高特特异异结合合以以及及既既可可偶偶联生生物物大大分分子子，又又可可连接接标记材材料料的的特特性性，使使该系系统在在标记免免疫疫分分析析技技术领域域中中的的应用用具具有有很很强的的稳定定性性和和适适用用性性。该系系统有有二二种种基基本本类型型：以以游游离离亲合合素素为中中间物物，分分别连接接包包含含生生物物素素化化大大分分子子的的待待检反反应体体系系和和标记生生物物素素的的BABBAB法法或或ABCABC技
26、技术；另另一一类是是直直接接用用标记亲合合素素连接接生生物物素素化化大大分分子子反反应体体系系进行行检测的的BABA法法或或LABLAB。此此外外，按按生生物物素素化化第第一一抗抗体体或或生生物物素素化化第第二二抗抗体体，又分又分为直接法或直接法或间接法接法BASBAS系系统。.v在在生生物物素素亲合合素素（链霉霉亲合合素素）放放大大系系统应用用中中，无无论采采用用酶、荧光光素素或或发光光物物作作为检测示示踪踪剂，均均是是待待测抗抗原原与与生生物物素素化化抗抗体体反反应形形成成复复合合物物后后，再再利利用用生生物物素素与与亲合合素素间的的多多价价放放大大结合合特特性性，或或直直接接与与标有有示示踪踪剂的的生生物物素素结合合（BABA、LABLAB法法），或或依依次次与与亲合合素素（链霉霉亲合合素素）、生生物物素素示示踪踪标记物物反反应连接接成成聚聚合合物物（BABBAB、ABCABC法法），最最终使使待待测反反应信信号号被被放放大，提高大，提高检测方法的灵敏度。方法的灵敏度。 .
