口腔快检 基因检测 科研服务 健康管理 广 东 爱 苏 生 物 科 技 有 限 公 司胶回收生物实验培训系列之九 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二1.胶回收的概念2.胶回收的原理 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 1.1 胶回收概念胶回收概念从电泳后的凝胶中回收目的DNA的过程，其目的是将目标DNA重新利用Lane M:1kb DNA MarkerLane 1:胶回收前的2.7kb DNA段Lane 2:胶回收后的2.7kb DNA段切割Lane 1后，经处理回收DNA，经电泳得到Lane 2。
切割回收4 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 1.2 胶回收原理胶回收原理利用核酸在裂解液下与硅胶膜吸附柱特异性结合，在洗脱液条件下被洗脱，从而达到核酸纯化回收的目的电泳后，切下凝胶称重后，加入等体积溶胶液上柱吸附DNA除胶脱盐洗脱5 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二1.分类2.应用 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1 分类分类7 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1.1 硅胶柱法硅胶柱法采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从凝胶中回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子等杂质。
最简单快速的回收方法不适合用于大片断的回收8 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1.2 玻璃奶玻璃奶/纯化填料法纯化填料法利用特殊玻璃微珠吸附DNA的特性，根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收玻璃奶/纯化填料法9 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1.3 低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65℃保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现已较少使用10 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1.4 透析带电洗脱法透析带电洗脱法切下的条带放在充满TAE的透析带中电泳，让 DNA跑出凝胶，跑向溶液中，再通过反向电泳，将附在透析带上的DNA赶回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后传统方法酚抽沉淀。
再次电泳后的胶通常还要再染色看看残留由于绑透析带很难操作，只有在回收非常大的片断时才会考虑的丙烯酰胺电泳凝胶产物回收的方法之一11 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.1.5 DEAE纤维素膜纸片法纤维素膜纸片法将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的DEAE 纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳，条带上的DNA被膜片截留，取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65℃保温洗脱，直到膜上DNA被完全洗脱，将溶液用酚氯仿抽提沉淀 早期实验室最常用方法之一这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困难12 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 2.2 应用应用13克隆克隆测序测序文库筛选文库筛选限制性酶切限制性酶切ＤＮＡ连接ＤＮＡ连接 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二1.试剂2.耗材3.设备 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 3.1 试剂试剂产品组成平衡液BL（BufferBL）溶胶液PN（BufferPN）漂洗液PW（BufferPW)洗脱缓冲液EB（BufferEB）吸附柱CA2（SpinColumnsCA2）收集管（2mL）（CollectionTubes2mL)15 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 3.2 耗材耗材各种规格移液枪、枪头 离心管16 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 3.3 设备设备离心机17 水浴锅 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 3.3 设备设备凝胶成像系统 水平电泳仪18 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二1.实验流程2.注意事项 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程向吸附柱CA2柱加入500μL平衡液BL14.1.1 柱平衡步骤柱平衡步骤12000rpm,离心1min2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中320 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程将目的条带从琼脂糖凝胶中切下14.1.2 切胶，称重切胶，称重放入干净的离心管中2称取重量321 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程向胶块中加入等体积溶液PN14.1.3 溶胶溶胶50℃水浴，不断温和地上下翻转离心管，确保胶块充分溶胶。
2注：注：注：注：1.1.如果凝胶重如果凝胶重如果凝胶重如果凝胶重0.1g0.1g，其体积可视为，其体积可视为，其体积可视为，其体积可视为100μL100μL，则加入，则加入，则加入，则加入100μL100μL溶液溶液溶液溶液PNPN 2. 2.若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直若胶块未完全溶胶，可继续放置几分钟或补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解至胶块完全溶解至胶块完全溶解至胶块完全溶解22 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程将所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min14.1.4 吸附吸附DNA12000rpm,离心30~60sec2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3注：吸附柱容积为注：吸附柱容积为注：吸附柱容积为注：吸附柱容积为800μL800μL，若样品体积大于，若样品体积大于，若样品体积大于，若样品体积大于800μL800μL可分批加入。
可分批加入可分批加入可分批加入23 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程向吸附柱CA2中加入μL漂洗液PW14.1.5 洗去杂质洗去杂质12000rpm,离心30~60sec2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中重复操作1,2,33注：注：注：注：1.1.漂洗液漂洗液漂洗液漂洗液PWPW使用前先检查是否已加入无水乙醇使用前先检查是否已加入无水乙醇使用前先检查是否已加入无水乙醇使用前先检查是否已加入无水乙醇 2. 2.如果回收的如果回收的如果回收的如果回收的DNADNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议直接测序，建议直接测序，建议直接测序，建议PWPW加入后静置加入后静置加入后静置加入后静置2~5min2~5min再离心24 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程将吸附柱CA2放回收集管中14.1.6 去除漂洗液去除漂洗液12000rpm,离心2min2将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，晾干3注：注：注：注：1.1.尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的尽量除尽漂洗液，以防止残留的漂洗液中的乙醇影响下一步的实验（如酶切、实验（如酶切、实验（如酶切、实验（如酶切、PCRPCR等）。
等）25 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.1 实验流程实验流程将吸附柱CA2放到一个干净离心管中14.1.7 收集收集DNA向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min212000rpm,离心2min收集DNA溶液326 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 原理：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动称为电泳利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术4.1 实验流程实验流程4.1.8 结果分析结果分析- 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳27 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围琼脂糖浓度（％）DNA有效分离范围（Kb）0.530～10.712～0.81.010～0.51.27～0.41.53～0.24.1 实验流程28 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 ①在锥形瓶中加入1mL50xTAE、49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；②放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷却至不烫手；③加入2.5μLNuclleicAcidStain核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝固。
琼脂糖凝胶制作上样电泳①取1μL上样缓冲液与5μL产物混匀②垂直加入上样孔中电泳条件：140V，20min4.1 实验流程实验流程4.1.8 结果分析结果分析- 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳29 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.2 结果分析结果分析—琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Ø将电泳结束后的凝胶放在凝胶成像系统中拍照保存Ø对结果进行分析：①看有无目的带②看是否存在非特异带③看条带亮度切割回收30 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.2 注意事项注意事项1.洗脱体积不应小于30μL，体积过少影响回收效率洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0~8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率31 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.2 注意事项注意事项2.平衡液BL的加入能够改善吸附柱的吸附能力并提高吸附柱的均一性和稳定性，消除高温/潮湿或其他不良环境因素对吸附柱造成的影响。
使用前请先检查平衡液BL是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清32 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.2 注意事项注意事项3.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果4.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液５.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10~30μL3M醋酸钠（pH5.2)将pH值调制5~7之间33 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 4.2 注意事项注意事项６.切胶是，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤7.回收<100bp及>10kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间8.回收率与初始DNA量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低34 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收基础知识一一目目 录录试剂耗材与设备三三操作流程四四常见问题解答五五 方法及应用二二 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 5 常见问题解答常见问题解答3636问题可能原因用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？胶溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例胶体积太大，可用枪头捣碎，若不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率TAE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致pH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好回收前的样品量太少，加大点样量洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 5 常见问题解答常见问题解答37问题解决方法加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测琼脂糖凝胶块不溶？琼脂糖质量不好含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4℃或-20℃制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 问题解答问题解答 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－试剂耗材与设备试剂耗材与设备试剂产品组成平衡液BL（BufferBL）溶胶液PN（BufferPN）漂洗液PW（BufferPW)洗脱缓冲液EB（BufferEB）吸附柱CA2（SpinColumnsCA2）收集管（2mL）（CollectionTubes2mL)耗材移液枪枪头离心管设备凝胶成像系统离心机水浴锅水平电泳仪 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－实验流程实验流程向吸附柱CA2柱加入500μL平衡液BL112000rpm,离心1min2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3１柱平衡１柱平衡步骤步骤将目的条带从琼脂糖凝胶中切下1放入干净的离心管中2称取重量3２切胶２切胶 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－实验流程实验流程３溶胶３溶胶４吸附４吸附向胶块中加入等体积溶液PN150℃水浴，不断温和地上下翻转离心管，确保胶块充分溶胶。
2将所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min112000rpm,离心30~60sec2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中3 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－实验流程实验流程５除杂质５除杂质６去漂洗液６去漂洗液向吸附柱CA2中加入μL漂洗液PW112000rpm,离心30~60sec2弃废液，将吸附柱重新放回收集管中重复操作1,2,33将吸附柱CA2放回收集管中112000rpm,离心2min2将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，晾干3 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－实验流程实验流程将吸附柱CA2放到一个干净离心管中1向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min212000rpm,离心2min收集DNA溶液3７收集ＤＮＡ７收集ＤＮＡ７收集ＤＮＡ７收集ＤＮＡ 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 胶回收标准实验流程－胶回收标准实验流程－实验流程实验流程８结果分析８结果分析①在锥形瓶中加入1mL50xTAE、49mL蒸馏水、0.4g琼脂糖，混匀；②放入微波炉中加热，约煮沸三次，冷却至不烫手；③加入2.5μLNuclleicAcidStain核酸染料，轻轻摇匀，避免产生气泡，倒入已垂直插好梳子的铺胶版中，待凝固。
琼脂糖凝胶制作上样电泳①取1μL上样缓冲液与5μL产物混匀②垂直加入上样孔中电泳条件：140V，20min 生物实验培训 理论学习 课堂演示 一对一带教 个人实操 爱苏生物 谢谢聆听！谢谢聆听！ 。