血红蛋白的提取和分离

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1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离主要内容：主要内容：一、基础知识一、基础知识二、实验操作二、实验操作2021/7/11一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法有效方法3 3、原理：、原理：2021

2、/7/124 4、具体过程、具体过程一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理2021/7/132021/7/14分子量分子量大大小小直径大小直径大小大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡在颗粒的外面在颗粒的外面小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进入无规则扩散进入颗粒内部颗粒内部运动速度运动速度较快较快较慢较慢运动路径运动路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出

3、来出来后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱出来出来一、基础知识一、基础知识-蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理蛋白质分离和提取的原理2021/7/15用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快D2021/7/16相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一

4、个B2021/7/171 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（ ）对溶液）对溶液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值2021/7/183 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成

5、。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的缓冲液。使用的缓冲液。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察(红色红色)和科学研究其和科学研究其(活性活性)4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？2021/7/19（三）（三） 电泳：电泳：1.1.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作

6、用下发生迁移的过程。2.2.原理：原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这下，这些基团会带上正电或负电。些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品

7、中各种分子的分离。各种分子的分离。3.3.类型类型: :琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。2021/7/110在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图2021/7/111 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三

8、维剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS。（2 2）原理：）原理：2021/7/112SDSSDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条肽由几条肽链组成的链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会解聚成单条肽链解聚成单条肽链，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是单

9、单条肽链的分子量条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形能与各种蛋白质形成成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物，SDSSDS所带负电荷的所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子量大大超过了蛋白质分子原有电荷量原有电荷量。因因而掩盖了而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别不同种蛋白质间的电荷差别，使，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。电泳迁移率完全取决于分子的大小。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理: : 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳2021/7/113使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳

10、迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异2021/7/114蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂）粗分离：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通

11、过聚丙烯酰胺凝胶）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定2021/7/115血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两

12、个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团1. 血液有哪些成分？血液有哪些成分？2. 2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哪种血液来提取血红蛋白？为什么？二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定知识回顾知识回顾2021/7/116（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：4 4、透析、透析：（：（如何除无机盐离子

13、和小分子有机物质呢？）如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？） 血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍体积生理盐水体积生理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明得到红色透明液体。液体。装入透析袋并置

14、于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析。）透析。二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定2021/7/117分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物2021/7/118透析过程动画演示透析过程动画演示2021/7/119练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，

15、首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2021/7/1202、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对

16、分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较2021/7/1213、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D

17、防止血液凝固防止血液凝固2021/7/1225、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数和和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀2021/7/123（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作-纯化纯化1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定

18、色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱2021/7/1242 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填步步骤操作要求操作要求操作要求操作要求色色谱柱垂直固定在支架上柱垂直固定在支架上计算称量凝算称量凝胶胶根据色根据色谱柱体柱体积计算凝胶用量算凝胶用量配制配制悬浮液浮液凝胶凝胶颗粒蒸粒蒸馏水水充分溶充分溶胀凝胶凝胶颗粒洗脱液粒洗脱液沸水浴沸水浴装填装填悬浮液浮液一次性一次性缓慢倒入；慢倒入；轻轻敲打敲打缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸立刻用磷酸缓冲液洗冲液洗涤平衡平衡12h12h2021/7/125装配好的凝胶柱2021/7/1263 3、样

19、品加入与洗脱、样品加入与洗脱-调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样加入蛋白质样品品品品调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质（1 1）调节缓冲液面：）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。（2 2）滴加透析样品：）滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要滴加样品时，吸管管口贴着

20、管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝破坏凝胶面。胶面。（3 3）样品渗入凝胶床：）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。（4 4）洗脱：）洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。（5 5）收集：）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收

21、集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）（6 6）注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。2021/7/127注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是正确的加样操作是（1 1）不要触及并破坏凝胶面。不要触及并破坏凝胶面。（2 2）贴壁加样。）贴壁加样。（3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动。）使吸

22、管管口沿管壁环绕移动。3 3、样品加入与洗脱、样品加入与洗脱-调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样品加入蛋白质样品加入蛋白质样品加入蛋白质样品调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质收集分装蛋白质2021/7/128思考下面的问题：思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。 1 1 1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的、在血红蛋白

23、的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？目的是什么？目的是什么？目的是什么？ 2 2 2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？点对你进行蛋白质得分离有什么意义？点对你进行蛋白质得分离有什么意义？点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程颜色来判断什么时候应

24、该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。 3 3 3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处样品处样品处样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋

25、白溶液，即，即: :样品的处理；样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通通通通过凝胶色谱法过凝胶色谱法过凝胶色谱法过凝胶色谱法将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即: :样品样品的纯化；最后经的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。2021/7/129收集得到的纯化后的蛋白2021/7/130在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是是A A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次、气

26、泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果序，降低分离效果B B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动C C、气泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应D D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密密A2021/7/131样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是A A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内床内C C等样品完全进

27、入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D D用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加到色谱透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面柱的顶端，不要破坏凝胶面A2021/7/132下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（作，其中正确的是（ ）A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液出液 A2021/7/133

28、三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。目的：目的：目的：目的：血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定2021/7/134 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-5-1818），），如果

29、分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。的提取纯度。四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有

30、气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打

31、柱体如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 2021/7/135 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3 3 3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分

32、离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？效果？效果？效果？四、实验结果分析与评价四、实验结果分析与评价本课题作业本课题作业本课题作业本课题作业; ; ; ;1.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? ?2.2.什么是缓冲溶液什么是缓冲溶液? ?它的作用是什么它的作用是什么? ?3.3.电泳的作用及

33、其原理是什么电泳的作用及其原理是什么? ?4.4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? ?5.5.与其他真核细胞相比与其他真核细胞相比, ,红细胞有什么特点红细胞有什么特点? ?这一特点对你进行这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义蛋白质的分离有什么意义? ?2021/7/1362021/7/1372021/7/138（1）计算：根据色谱柱的内体积计算所需）计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量凝胶量（2）凝胶溶胀：）凝胶溶胀：凝胶浸泡于蒸馏水充分溶凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液胀后，配成凝胶悬浮液（3）固定：固定：将色谱柱装置固定在支架上将色谱柱装置

34、固定在支架上（4）装填：装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。（5）洗涤平衡：）洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml的的20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH为为7.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡12小时小时。装填时装填时注意：注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得

35、有气泡存在：因为气泡因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时洗涤平衡时注意：注意：注意：注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。2 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填2021/7/1394 4、用、用SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳测定聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白

36、质分子量的方法蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定蛋白质的分子量时，可选用一组蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子已知分子量的标准蛋白量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以，可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。试剂出售。2021/7/140 结束语结束语若有不当之处，请指正，谢谢！若有不当之处，请指正，谢谢！