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1、 第五章第五章 毛细管电泳法毛细管电泳法Capillary Electrophoresis 本章要求本章要求 了解电泳、淌度、电渗的概念了解电泳、淌度、电渗的概念 了解毛细管电泳仪的结构了解毛细管电泳仪的结构 了解六种毛细管电泳分离模式了解六种毛细管电泳分离模式 毛细管电泳capillary electrophoresis，CE又称高效毛细管电泳HPCE），是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的液相分离技术。 CE 实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。5.1 基本
2、概念和原理基本概念和原理 在在电电解解质质溶溶液液中中，带带电电粒粒子子在在直直流流电电场场的的作作用用下下，以以不不同同的的速速度度或或速速率率向向其其所所带带电电荷荷相相反反电电场场方方向向迁迁移移的的现现象象。阴阴离离子子向向正正极极方方向向迁迁移移，阳阳离离子子向向负负极极方方向向迁迁移移，中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。 利利用用这这些些带带电电粒粒子子在在电电场场中中迁迁移移速速度度的的不不同同而而达达到到分分离的技术称为电泳。离的技术称为电泳。1. 电泳电泳2. 毛细管电泳：毛细管电泳：CE 以以高高压压电电场场为为驱驱动动力力，以以毛毛细
3、细管管为为分分离离通通道道，利利用用被被分分析析离离子子在在电电场场作作用用下下移移动动速速率率不不同同而而达达到到分分离离的的目目的的，主主要要用用于分析在毛细管缓冲溶液中离解为离子的物质。于分析在毛细管缓冲溶液中离解为离子的物质。毛细管的内径比头发丝还细得多10-30千伏电压3. 淌度淌度淌度：单位电场下的电泳速度。淌度：单位电场下的电泳速度。绝对淌度：在无限稀释溶液中稀溶液数据外推测绝对淌度：在无限稀释溶液中稀溶液数据外推测得的淌度称为绝对淌度，得的淌度称为绝对淌度，0em电泳速率：待测物从进样端到检测窗口的迁移速度，电泳速率：待测物从进样端到检测窗口的迁移速度，vem em：cm2/(
4、s V)； vem ：cm/s； E：V/cm4. 电渗电渗毛毛细细管管内内充充满满溶溶液液 pH 3时时，管管内内 Si-OH 电电离离 SiO- 基基，毛毛细细管管壁壁带带负负电电，与与溶溶质质界界面面上上形形成成双双电电层层。在在双双电电层层的的扩散外层中，阳离子向阴极移动，带动溶液形成轴向流动。扩散外层中，阳离子向阴极移动，带动溶液形成轴向流动。在在毛毛细细管管中中电电渗渗速速度度可可比比电电泳泳速速度度大大一一个个数数量量级级，所所以以能能实实现现样样品品组组分分同同向向泳泳动动。正正离离子子的的运运动动方方向向和和电电渗渗流流一一致致，最最先先流流出出；中中性性粒粒子子的的电电泳泳
5、流流速速度度为为“零零”，其其迁迁移移速速度度相相当当于于电电渗渗流流速速度度；负负离离子子的的运运动动方方向向和和电电渗渗流流方方向向相相反反，但但因因电电渗渗流流速速度度一一般般都都大大于于电电泳泳速速度度，在在中中性性粒粒子子之之后后流流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。离子的出峰次序为：正离子离子的出峰次序为：正离子 中性分子中性分子 负离子负离子电渗流的作用：电渗流的作用： 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离。可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离。 改改变变电电渗渗流流的的大大小小和和方方向向，可可改改变变分分离离效效率率和
6、和选选择择性性，也是也是CE与与HPLC相比能优化分离的重要因素。相比能优化分离的重要因素。 电电渗渗流流的的微微小小变变化化影影响响结结果果的的重重现现性性，控控制制电电渗渗流流恒恒定定是是CE分析关键所在。分析关键所在。 电渗流在电渗流在CE中起到像中起到像HPLC中的泵一样作用。中的泵一样作用。铂电极铂电极缓冲溶液缓冲溶液高压电源高压电源毛细管毛细管5.2 毛细管电泳装置毛细管电泳装置1. 进样系统进样系统电动进样；压力进样；扩散进样。电动进样；压力进样；扩散进样。进样体积一般在纳升级。进样体积一般在纳升级。2. 分离系统分离系统毛细管：毛细管： 熔融石英，长熔融石英，长40100 cm
7、，内径，内径25100 m；恒温系统：控制柱温变化在恒温系统：控制柱温变化在0.1； 高压电源：电流高压电源：电流0300 A，电压，电压030 kV (稳定性稳定性0.1%)3. 检测系统检测系统4. 数据处理系统数据处理系统紫外紫外-可见检测器可见检测器 ；激光诱导荧光检测器；电化学检测器。；激光诱导荧光检测器；电化学检测器。5.3 毛细管电泳分离模式毛细管电泳分离模式6种分离模式：种分离模式： 毛细管区带电泳毛细管区带电泳CZE 毛细管等速电泳毛细管等速电泳CITP 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦CIEF 毛细管电色谱毛细管电色谱CEC 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱MECC 毛细管
8、凝胶电泳毛细管凝胶电泳CGE1. 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 (CZE) 用用CZE时，整个系统用一种缓冲溶液时，整个系统用一种缓冲溶液 (背景电解质背景电解质)，根据，根据各组分荷质比不同而分离。背景电解质仅起各组分荷质比不同而分离。背景电解质仅起传导电流的作用。传导电流的作用。 t 0 t 02. 毛细管等速电泳毛细管等速电泳CITP） 使使用用两两种种电电解解质质：一一种种为为迁迁移移率率较较高高的的前前导导离离子子L电电解解质质，一一种种为为迁迁移移率率较较低低的的尾尾随随离离子子T电电解解质质，被被分分离离组组分分夹夹在在L与与T之间，以同一速度运动，由于迁移率不同而分离。之间，以
9、同一速度运动，由于迁移率不同而分离。3. 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 (CIEF) 基本操作步骤：进样、聚焦和迁移，用于生物大分子的分离。基本操作步骤：进样、聚焦和迁移，用于生物大分子的分离。毛细管等电聚焦电泳的运行过程毛细管等电聚焦电泳的运行过程 (a)进样；进样；(b)聚焦；聚焦；(c)迁移迁移4. 毛细管电色谱毛细管电色谱 (CEC) 分为填充柱和开管柱两种方式，可分离离子和中性分子，且分为填充柱和开管柱两种方式，可分离离子和中性分子，且可分离手性分子。可分离手性分子。5. 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 (MECC) 两相：流动的水相和起固定相作用的胶束相两相：流动的水相和起固
10、定相作用的胶束相(准固定相准固定相)，被测组分由于在水相和胶束相之间分配系数的差异而分离。被测组分由于在水相和胶束相之间分配系数的差异而分离。5.4 毛细管电泳特点及应用毛细管电泳特点及应用(1) 高分辨率：理论塔板数高达数百万块至数千万块。高分辨率：理论塔板数高达数百万块至数千万块。(2) 高灵敏度：可检测出低至高灵敏度：可检测出低至10-20 mol浓度的物质。浓度的物质。(3) 高分析速度：可高分析速度：可3 min内分离内分离30种阴离子；种阴离子；1.7 min内分离内分离19种阳离子；种阳离子；4 min内分离内分离10种蛋白质。种蛋白质。(4) 试样用量少：仅需几试样用量少：仅需
11、几nL (10-9 L)的试样。的试样。(5) 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升。仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升。(6) 自动：自动：CE是目前自动化程度最高的分离方法。是目前自动化程度最高的分离方法。(7) 通常使用水溶液，对人和环境无害。通常使用水溶液，对人和环境无害。1. 优点优点HPLC中中，纵纵向向扩扩散散和和传传质质阻阻力力是是影影响响谱谱峰峰展展宽宽的的重重要要因因素，而素，而CE只有纵向扩散影响谱峰展宽，塔板数：只有纵向扩散影响谱峰展宽，塔板数：D: 组分扩散系数组分扩散系数U：毛细管两端施加电压：毛细管两端施加电压可可采采用用2000060000V的
12、的高高压压，分分离离速速度度和和分分离离度度有有明明显显的改善，的改善，N为为(12)105，HPLC的的N为为51032104。理论塔板数理论塔板数(1) 进样不够方便。进样不够方便。(2) 分析阴离子时，出峰时间较长。电渗会因样品组成而变分析阴离子时，出峰时间较长。电渗会因样品组成而变化，影响分离重现性。化，影响分离重现性。(3) 光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰。光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰。2. 缺陷缺陷毛细管电泳与高效液相色谱比较：毛细管电泳与高效液相色谱比较： 操作简单，试样量少。操作简单，试样量少。 分离效率高，成本低。分离效率高，成本低。 迁移时间的重现
13、性、进样的准确性和灵敏度比迁移时间的重现性、进样的准确性和灵敏度比HPLC差。差。3. 运用运用毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域也有较多应用，如临床疾病诊断、临床蛋白分医学等领域也有较多应用，如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、PCR产物分析、产物分析、DNA片段及序列分析等。片段及序列分析等。可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验。体液或组织及其实验动物活体实验。除除分分离离生生物物大大分分子子肽肽、蛋蛋白白、 DNA、糖糖等等外外，还还可可用用于于小小分分子子氨氨基基酸酸、药药物物等等及及离离子子无无机机、有有机机），甚甚至至可可以以分分离离各各种种颗颗粒粒硅硅胶胶颗颗粒粒等等）。从从无无机机离离子子到到整整个细胞，具有个细胞，具有“万能分析功能或潜力。万能分析功能或潜力。 本章要求本章要求 了解电泳、淌度、电渗的概念了解电泳、淌度、电渗的概念 了解毛细管电泳仪的结构了解毛细管电泳仪的结构 了解六种毛细管电泳分离模式了解六种毛细管电泳分离模式
