核酸杂交技术PPT课件

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1、第八章第八章核酸杂交技术核酸杂交技术第一节第一节核酸杂交的概念和原理核酸杂交的概念和原理n一、基本原理：一、基本原理：nDNA的变性和复性。的变性和复性。n1、变性：在热变性过程、变性：在热变性过程中，中，DNA双螺旋被解开一双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度半时的温度称为变性温度或解链温度（或解链温度（melting-temperature,Tm）。）。n（1）解链温度解链温度Tm：每一每一种种DNA都有一个解链温度，都有一个解链温度，通常通常Tm值在值在60。（2）影响）影响Tm值的因素：值的因素：DNA碱基组成：碱基组成：G-C含含量越多，量越多，Tm值越高；值越高；溶液的离子强度：低

2、离溶液的离子强度：低离子强度，子强度，Tm值较低，而值较低，而且解链的温度范围较宽；且解链的温度范围较宽；高离子强度，高离子强度，Tm值较高，值较高，解链温度较窄。解链温度较窄。pH值：溶液值：溶液pH值在值在59范围内，范围内，Tm值变化不值变化不明显。明显。变性剂：各种变性剂主变性剂：各种变性剂主要干扰碱基堆积力和氢要干扰碱基堆积力和氢键的形成而降低键的形成而降低Tm值。值。Tm0.41(GC)%69.3n2 2、复性：、复性：n变性的变性的DNADNA两条互补单链，在适当条件下两条互补单链，在适当条件下重新缔合成双链的过程为重新缔合成双链的过程为DNADNA复性。复性。n核酸杂交技术就是

3、利用核酸杂交技术就是利用DNADNA变性再复性的变性再复性的原理，进行的一项核酸检测技术。原理，进行的一项核酸检测技术。n杂交分子可以在杂交分子可以在DNADNA和和DNADNA、DNADNA和和RNARNA、RNARNA和和RNARNA以及以及人工合成的寡核苷酸单链人工合成的寡核苷酸单链与与RNARNA或或DNADNA单链单链之间形成杂交分子。之间形成杂交分子。 n二、核酸杂交的概念二、核酸杂交的概念n核酸分子杂交核酸分子杂交( (nucleicacidhybridization)是指具有互补序列的两是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形

4、成双链的过程。则形成双链的过程。n通过将标记的已知核酸片段作为通过将标记的已知核酸片段作为探针探针，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到样本核酸中相应的基因。察到样本核酸中相应的基因。n根据检测对象和手段不同可将杂交枝术分根据检测对象和手段不同可将杂交枝术分为不同类型，常见的有四种类型为不同类型，常见的有四种类型SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（DNADNA印迹杂交）印迹杂交）NorthernNorthern印迹杂交（印迹杂交（RNARNA印迹杂交）印迹杂交）原位杂交技术（原位杂交技术（in situ hybridizationin sit

5、u hybridization）斑点及狭缝杂交斑点及狭缝杂交(dot blot (dot blot hybridization) hybridization) n根据杂交体系的不同，核酸杂交可以分为根据杂交体系的不同，核酸杂交可以分为液相杂交和固相杂交。液相杂交和固相杂交。n固相杂交是将待测核酸先固定在固相支持物上，固相杂交是将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上。体结合在固相支持物上。第二节第二节核酸探针与标记核酸探针与标记n一、探针的概念一、探针的概念n探针（探针（probe)：广义上讲，探针

6、是指能与特定靶广义上讲，探针是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。测的分子。n如：抗原抗体，生物素亲合素，受体配体如：抗原抗体，生物素亲合素，受体配体等。等。n核酸探针核酸探针：是指能与特定核苷酸序列发生特异互：是指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知的被补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知的被标记的核苷酸链。标记的核苷酸链。n二、探针的种类二、探针的种类n根据探针的来源和性质可分为：基因组根据探针的来源和性质可分为：基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、RNA探针、探针、cRNA探针和

7、人工合成的寡核苷酸探针探针和人工合成的寡核苷酸探针等。等。n选择探针的原则：选择探针的原则：1）要有高度的特异性）要有高度的特异性2）容易制备）容易制备3）灵敏性）灵敏性n1、基因组、基因组DNA探针（最常用）探针（最常用）n为某一基因的全部或部分序列，但这些片段必须为某一基因的全部或部分序列，但这些片段必须是特异的。是特异的。n制备制备：从基因文库选取某一基因片段，进行克隆：从基因文库选取某一基因片段，进行克隆后酶切获得。后酶切获得。n也可以应用聚合酶链反应（也可以应用聚合酶链反应（PCR）扩增扩增DNA特定特定片段。片段。n优点优点：n1）多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备方）多克隆在

8、质粒载体中，可以无限繁殖，制备方法简单法简单n2）相对）相对RNA而言而言DNA探针不易降解探针不易降解n3）DNA探针标记方法较成熟。探针标记方法较成熟。n2、cDNA探针探针ncDNA（complementary)是互补于是互补于mRNA的的DNA分子。分子。n它是以它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，为模板，根据碱基配对原则，经逆转录酶（经逆转录酶（reversetranscriptase)催化催化合成的合成的DNA。n优点：不存在内含子和高度重复序列优点：不存在内含子和高度重复序列n缺点：不易获得，限制了其应用。缺点：不易获得，限制了其应用。n3、RNA探针探针nmRNA探针是一类有

9、特殊用途的核酸探针。探针是一类有特殊用途的核酸探针。n优点：优点：1）因是单链，所以与靶序列杂交效率高。）因是单链，所以与靶序列杂交效率高。2）因无高度重复序列，所以杂交特异性也高。）因无高度重复序列，所以杂交特异性也高。n缺点：缺点：1）易降解；）易降解；2）标记方法复杂）标记方法复杂n用途：用途：1）可用于检测）可用于检测DNA和和mRNA2）在研究基因表达时，常用于观察该基因的转录在研究基因表达时，常用于观察该基因的转录情况。情况。n4、寡核苷酸探针（人工合成）、寡核苷酸探针（人工合成）n优点：优点：1）可根据需要合成相应序列）可根据需要合成相应序列2）探针短，序列复杂性低，容易与靶点完

10、）探针短，序列复杂性低，容易与靶点完全杂交。全杂交。3）长度只有）长度只有1015bp，从而能降低杂交从而能降低杂交Tm值。值。4）可大量合成，使该探针价格低。）可大量合成，使该探针价格低。n三、探针标记物三、探针标记物n探针标记物的特性：探针标记物的特性：n1）具有高度灵敏性，高度特异性。）具有高度灵敏性，高度特异性。n2）标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基）标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对，也不影响探针的主要理化特性。配对，也不影响探针的主要理化特性。n3）检测方法假阳性率低，价格低，对环境污）检测方法假阳性率低，价格低，对环境污染少。染少。n4）若用酶促方法标记，应对酶的活性影

11、响不）若用酶促方法标记，应对酶的活性影响不大。大。n（一）放射性同位素标记物（最常用）（一）放射性同位素标记物（最常用）n优点优点：检测特异性强，灵敏度高，对各种酶：检测特异性强，灵敏度高，对各种酶促反应无影响，也不影响碱基配对。促反应无影响，也不影响碱基配对。n缺点缺点：容易造成放射性污染：容易造成放射性污染n常用同位素常用同位素：32P，3H，35Sn也有用也有用131I，14Cn在在Southern印迹杂交中以印迹杂交中以32P最常用。最常用。n32P主要以主要以-32PNTP或或-32PdNTP形形式通过酶促反应掺入核酸探针，式通过酶促反应掺入核酸探针，n（二）非放射性标记物（二）非放

12、射性标记物n根据检测方法不同，分为：根据检测方法不同，分为：n1、半抗原半抗原：生物素（：生物素（biotin)和地高辛（和地高辛（DIG)较常较常用。半抗原与抗体进行免疫学检测。（较常用）用。半抗原与抗体进行免疫学检测。（较常用）n2、配体配体：生物素还是亲合素（：生物素还是亲合素（avidin)的配体。的配体。n3、荧光素荧光素：如异硫氰酸荧光素（：如异硫氰酸荧光素（FITC)和罗丹明，和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。可被紫外线激发出荧光而被检测到。n4、化学发光探针化学发光探针：一些标记物可与某种物质反应：一些标记物可与某种物质反应产生化学发光现象。产生化学发光现象。生物素生物

13、素-11-dUTP生物素是亲和素（生物素是亲和素（avidin）的天然配体。用生物素化）的天然配体。用生物素化探针与待测核酸杂交之后，可以用偶联有报道酶（例探针与待测核酸杂交之后，可以用偶联有报道酶（例如碱性磷酸酶）的亲和素与杂交体结合，然后，加报如碱性磷酸酶）的亲和素与杂交体结合，然后，加报道酶底物（例如碱性磷酸酶的底物道酶底物（例如碱性磷酸酶的底物X-磷酸酯），通过磷酸酯），通过呈色反应或产生发光产物进行分析呈色反应或产生发光产物进行分析n四、探针标记方法四、探针标记方法n核酸标记可以在体内进行，也可以在体外进行。核酸标记可以在体内进行，也可以在体外进行。n体外标记法分为化学法和酶促法。体

14、外标记法分为化学法和酶促法。n化学法化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生化学反应将标记物直接连接到探子上的基团发生化学反应将标记物直接连接到探针分子上。针分子上。n酶促法酶促法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中。分子中。n1、切口平移法（、切口平移法（nicktranslation)（最常用）最常用）n用大肠杆菌的用大肠杆菌的DNA聚合酶聚合酶I将将DNA分子的一条链上随分子的一条链上随机切开若干切口（机切开若干

15、切口（nick)，切口处形成切口处形成3-OH末端末端n再在再在DNA聚合酶聚合酶I的催化下，在切口的催化下，在切口3-OH末端逐个末端逐个加上新的加上新的dNTP（其中有一种预先标记了其中有一种预先标记了32P）。）。n利用本法可以制备序列特异的探针利用本法可以制备序列特异的探针n切口平移标记探针平均长度约为切口平移标记探针平均长度约为600个核苷酸。个核苷酸。5ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA33TAGCATCGCTAATCCGGATGGCT5切口平移法（切口平移法（nick translation)DNA聚合酶聚合酶I假设：假设：dGTP用用32Pn用用DNase在在DNA

16、双链上随机切割磷酸二酯键，双链上随机切割磷酸二酯键，形成多个切口；形成多个切口；n利用大肠杆菌利用大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶通过切口平移降解通过切口平移降解原有原有DNA片段，用标记核苷酸作为底物合成标记片段，用标记核苷酸作为底物合成标记DNA片段；片段；n除去未掺入的标记核苷酸，获得除去未掺入的标记核苷酸，获得DNA探针。探针。n2、随机引物法（、随机引物法（randompriming)n随机引物是人工合成的一段含有随机引物是人工合成的一段含有68个核苷个核苷酸的寡核苷酸片段。酸的寡核苷酸片段。n这段寡核苷酸片段随机与已经变性的这段寡核苷酸片段随机与已经变性的DNA或或RNA单链结合。单链结

17、合。n在反应体系中加入大肠杆菌在反应体系中加入大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶IKlennow片段和片段和dNTP（预先用预先用32P标记），标记），n在寡核苷酸的在寡核苷酸的3-OH末端，互补合成一条新末端，互补合成一条新的的DNA链，这条链就是被标记的探针。链，这条链就是被标记的探针。3ATCGTAGCGATTAGGCCTACCGA55TAGCA3随机引物法（随机引物法（random priming)Klennow片段片段假设：假设：dGTP用用32Pn将探针模板变性，与随机引物退火；将探针模板变性，与随机引物退火；n加加Klenow片段，以一种标记片段，以一种标记dNTP和三和三种普通种普通d

18、NTP为底物，合成标记为底物，合成标记DNA；n变性解链，得到标记变性解链，得到标记DNA探针探针n3、末端标记法、末端标记法n1）5末端标记末端标记n本法要求本法要求DNA或或RNA分子分子5末端是末端是-OH先用碱性磷酸酶切除先用碱性磷酸酶切除DNA或或RNA5末端的磷酸基末端的磷酸基团，使其成为团，使其成为5OH然后，在然后，在32PATP存在下，经存在下，经T4噬菌体多核噬菌体多核苷酸激酶（苷酸激酶（polynucleotidekinase,PNK)催化下，催化下，将将位上的位上的32P转移到转移到DNA或或RNA分子的分子的5-OH末末端。端。n2）3末端标记末端标记n用小牛胸腺末端

19、转移酶，在用小牛胸腺末端转移酶，在3-OH末端末端连接一个连接一个32PdATPn末端标记法一般很少用于核酸杂交，常末端标记法一般很少用于核酸杂交，常用于用于DNA测序。测序。n3）替代合成标记法）替代合成标记法n对于对于3黏端和平端黏端和平端DNA，利用，利用T4DNA聚合酶聚合酶和和Klenow片段的片段的35外切酶活性，可以将其外外切酶活性，可以将其外切成切成5黏端，然后再利用黏端，然后再利用T4DNA聚合酶和聚合酶和Klenow片段的片段的53聚合酶活性，加入标记聚合酶活性，加入标记dNTP底物进行标记。底物进行标记。n对于具有对于具有5黏端的黏端的DNA，可以直接利，可以直接利T4D

20、NA聚聚合酶和合酶和Klenow片段的片段的53聚合酶活性，加入标聚合酶活性，加入标记记dNTP底物进行标记。底物进行标记。n4、PCR标记法标记法n在在PCR反应底物中，加入标记了的反应底物中，加入标记了的dNTP，这样，标记了的这样，标记了的dNTP就可以在就可以在PCR反应的反应的同时掺入到新合成的同时掺入到新合成的DNA链上。可以作为链上。可以作为探针。探针。n聚合酶链反应标记法适合于合成短链探针聚合酶链反应标记法适合于合成短链探针五、探针的纯化五、探针的纯化n常用的探针纯化方法有乙醇沉淀法和凝胶过滤法。常用的探针纯化方法有乙醇沉淀法和凝胶过滤法。n1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法nDNA片段

21、可以被无水乙醇沉淀，而片段可以被无水乙醇沉淀，而dNTP等小分子等小分子物质则留于上清液中。因此，用无水乙醇沉淀物质则留于上清液中。因此，用无水乙醇沉淀23次即可将探针与其他成分分离，达到纯化目的。乙次即可将探针与其他成分分离，达到纯化目的。乙醇沉淀法操作简便，是纯化探针的首选方法。醇沉淀法操作简便，是纯化探针的首选方法。n2.凝胶过滤法凝胶过滤法n凝胶过滤法是利用凝胶的分子筛特性，将大分子核凝胶过滤法是利用凝胶的分子筛特性，将大分子核酸与小分子酸与小分子dNTP有效分离。常用的凝胶填料是有效分离。常用的凝胶填料是SephadexG-50和和Bio-GelP-60。如果洗脱液体。如果洗脱液体积

22、过大，可以用乙醇沉淀法进行浓缩。积过大，可以用乙醇沉淀法进行浓缩。第三节固相支持物与印迹第三节固相支持物与印迹n一、固相支持物一、固相支持物1.硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜n硝酸纤维素膜是最早用于固定硝酸纤维素膜是最早用于固定DNA的固相膜，的固相膜，n优点优点：本底较低、操作简便。被广泛应用于：本底较低、操作简便。被广泛应用于DNA印迹、印迹、RNA印迹和斑点杂交等。印迹和斑点杂交等。n缺点缺点：核酸与硝酸纤维素膜以疏水作用结合，核酸与硝酸纤维素膜以疏水作用结合，因而结合不太牢固，在杂交之后的洗膜过程中可因而结合不太牢固，在杂交之后的洗膜过程中可能会被洗脱；能会被洗脱；核酸与硝酸纤维素膜的结合受

23、离核酸与硝酸纤维素膜的结合受离子强度影响，需要较高的离子强度；子强度影响，需要较高的离子强度；硝酸纤维硝酸纤维素膜在碱性条件下不能结合核酸，并且长时间置素膜在碱性条件下不能结合核酸，并且长时间置于碱性溶液中会破裂，所以不适合于在碱性溶液于碱性溶液中会破裂，所以不适合于在碱性溶液中使用；中使用；硝酸纤维素膜在真空硝酸纤维素膜在真空80烘烤固定时烘烤固定时会变脆，很难进行多轮杂交。会变脆，很难进行多轮杂交。n2.尼龙膜尼龙膜n尼龙膜韧性较强，不易破裂。在酸性、碱性、中尼龙膜韧性较强，不易破裂。在酸性、碱性、中性、各种离子强度条件下，核酸均可以共价键与性、各种离子强度条件下，核酸均可以共价键与尼龙膜

24、结合，非常牢固。在保持完整的情况下，尼龙膜结合，非常牢固。在保持完整的情况下，尼龙膜可以多轮杂交，即在第一轮杂交之后，将尼龙膜可以多轮杂交，即在第一轮杂交之后，将探针分子变性洗脱，可以再与第二种探针杂交。探针分子变性洗脱，可以再与第二种探针杂交。n用于印迹杂交的尼龙膜有普通尼龙膜和正电荷修用于印迹杂交的尼龙膜有普通尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜两种。正电荷修饰尼龙膜与核酸的结合饰尼龙膜两种。正电荷修饰尼龙膜与核酸的结合能力更强，灵敏度更高。能力更强，灵敏度更高。二、印迹方法二、印迹方法n印迹（印迹（blotting）是指将凝胶中的待测核酸等样）是指将凝胶中的待测核酸等样品用类似于吸墨迹的方法转移到固

25、相膜上，转移品用类似于吸墨迹的方法转移到固相膜上，转移之后待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。之后待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。n1.毛细管转移法毛细管转移法n利用虹吸作用使缓冲溶液定向渗透，带动样品从利用虹吸作用使缓冲溶液定向渗透，带动样品从凝胶中转移到固相膜上。样品转移速度主要取决凝胶中转移到固相膜上。样品转移速度主要取决于样品分子大小、凝胶浓度和凝胶厚度。于样品分子大小、凝胶浓度和凝胶厚度。n有两种毛细管法：有两种毛细管法：向上毛细管法：液流自下而上虹吸向上毛细管法：液流自下而上虹吸向下毛细管法：液流自上而下虹吸，向下毛细管法：液流自上而下虹吸，向上毛细管法：向上毛细管法：液流

26、自下而上虹液流自下而上虹吸吸向下毛细管法：向下毛细管法：液流自上而下虹液流自上而下虹吸，吸，n2真空转移法真空转移法n是利用真空作用将缓冲溶液从上层储液器中通过是利用真空作用将缓冲溶液从上层储液器中通过凝胶和固相膜抽到下层真空室内，同时带动样品凝胶和固相膜抽到下层真空室内，同时带动样品分子移出，结合到固相膜上。分子移出，结合到固相膜上。n优点优点：简便、快速、高效，并且可以在转移的同：简便、快速、高效，并且可以在转移的同时对核酸进行变性和中和处理。时对核酸进行变性和中和处理。n注意事项注意事项：保持凝胶表面平整，厚度均匀，否则：保持凝胶表面平整，厚度均匀，否则在真空作用下凝胶会破裂；在转移过程

27、中真空度在真空作用下凝胶会破裂；在转移过程中真空度不宜过高，以免凝胶被压紧，反而降低转移效率。不宜过高，以免凝胶被压紧，反而降低转移效率。n3电转移法电转移法n是通过电泳使凝胶中的带电荷样品沿着与凝胶平是通过电泳使凝胶中的带电荷样品沿着与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，结合到固相面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，结合到固相膜上，是一种简便、快速、高效的转移方法。膜上，是一种简便、快速、高效的转移方法。n核酸电转移法一般选用尼龙膜而不是硝酸纤维素核酸电转移法一般选用尼龙膜而不是硝酸纤维素膜作为固相膜膜作为固相膜第四节第四节核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术一、一、Southern印迹杂交（印迹

28、杂交（Southernblotting)又叫又叫DNA印迹技术。是印迹技术。是1975年由年由英国爱丁堡大学的英国爱丁堡大学的E.Southern发明的。发明的。该技术是该技术是DNA与与DNA的杂交。的杂交。Southern印迹杂交是印迹杂交是将电泳分离的待测将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定固相支持物上与片段转印并结合到一定固相支持物上与探针杂交，用标记过的探针检测待测探针杂交，用标记过的探针检测待测DNA的的一种方法。一种方法。（一）基本步骤（一）基本步骤样品样品制备制备电泳分离电泳分离变性变性印迹印迹固定固定预杂交预杂交杂交杂交洗膜洗膜检测与检测与分析分析1 1、样品制备、样品

29、制备n基因组基因组DNA是从动物细胞或组织中提取。是从动物细胞或组织中提取。n1 1）破碎细胞：）破碎细胞：化学法裂解细胞，化学法裂解细胞， 用用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞。n2 2）用蛋白酶和）用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质酶消化大部分蛋白质和和RNA。n3 3）用有机溶剂（酚氯仿）抽提的方法除去）用有机溶剂（酚氯仿）抽提的方法除去残余蛋白质。残余蛋白质。n4 4）用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化，将将其其切切割割成成大大小不同的片段之后才能用于杂交分析。小不同的片段之后才能用于杂交分析。2 2、电泳分离、电泳分离n将制备好的将制备好的DNA

30、样品在样品在0.8%1.0%琼脂糖凝胶中电泳分离琼脂糖凝胶中电泳分离DNA。n3 3、DNA的变性的变性n电电泳泳结结束束后后，对对凝凝胶胶中中的的DNADNA进进行行碱碱变变性性及中和处理。及中和处理。n将将凝凝胶胶置置于于碱碱溶溶液液中中浸浸泡泡，使使DNADNA原原位位变变性性解解链链，形形成成单单链链DNADNA片片段段，再再用用中中性性pHpH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4 4、印迹印迹n将变性后的单链将变性后的单链DNA转移到固相支持转移到固相支持物上的过程称为印迹。物上的过程称为印迹。5 5、固定、固定 n转移之后的转移之后的DNA必须固定于固相膜上。

31、必须固定于固相膜上。n80烘烤可以将烘烤可以将DNA固定于固相膜上，小固定于固相膜上，小剂量紫外线可以使剂量紫外线可以使DNA以共价键与尼龙膜以共价键与尼龙膜结合。结合。6、预杂交和、预杂交和杂交杂交n预杂交预杂交：将固定后的：将固定后的DNA样品用样品用变性的鲑鱼变性的鲑鱼精子精子DNA等非特异性的等非特异性的DNADNA分子封闭固相膜上分子封闭固相膜上未结合未结合DNADNA的位点，以避免探针的非特异性结的位点，以避免探针的非特异性结合，降低杂交的本底合，降低杂交的本底。n杂交杂交：加入标记好的探针进行杂交。：加入标记好的探针进行杂交。n用探针杂交液浸泡结合了待测用探针杂交液浸泡结合了待测

32、DNA的固相膜，的固相膜，温育，探针即与待测温育，探针即与待测DNA片段进行杂交。片段进行杂交。7、洗膜、洗膜n用不同离子强度的漂洗液依次漂洗固用不同离子强度的漂洗液依次漂洗固相膜，除去末杂交探针和形成非特异相膜，除去末杂交探针和形成非特异性杂交体的探针，称为洗膜。性杂交体的探针，称为洗膜。n非特异性杂交体稳定性差，解链温度非特异性杂交体稳定性差，解链温度低，可以在比特异性杂交体解链温度低，可以在比特异性杂交体解链温度低低5l2的条件下解链，而特异性杂的条件下解链，而特异性杂交体不会解链。交体不会解链。8 8、检测与分析、检测与分析n杂交信号的检测方法有两种：杂交信号的检测方法有两种：n一种是

33、放射自显影。用于同位素或发光一种是放射自显影。用于同位素或发光剂标记的核酸探针与待测剂标记的核酸探针与待测DNA杂交洗膜杂交洗膜后，将纤维素膜和后，将纤维素膜和X光片一起装入暗盒，光片一起装入暗盒，使使X光片曝光，冲洗后，在光片曝光，冲洗后，在X光片上可见光片上可见黑色条带。黑色条带。n另一种是化学染色。可直接在膜上显色，另一种是化学染色。可直接在膜上显色，显出杂交条带。显出杂交条带。 （二）应用（二）应用nSouthern杂交技术主要用于：杂交技术主要用于：组建组建DNADNA物理图谱。物理图谱。研究基因重排，变异以及基因的限制性内研究基因重排，变异以及基因的限制性内切酶酶切片段长度多态性分

34、析。切酶酶切片段长度多态性分析。用于对疾病的诊断用于对疾病的诊断。二、二、Northern印迹杂交（印迹杂交（Northernblotting）n19791979年年J.C J.C AlwineAlwine将将RNARNA转移到化学修移到化学修饰的的活性活性滤纸上而上而发明此法。明此法。n1 1、概念：、概念：NorthernNorthern印迹杂交是将印迹杂交是将RNARNA从电从电泳凝胶中转移到硝酸纤维膜上或其它化学泳凝胶中转移到硝酸纤维膜上或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种方法。方法。 n用于检测用于检测RNARNA（主要是主要是mRNAm

35、RNA）, ,用于研究基用于研究基因表达。因表达。 n2、基本步骤：、基本步骤：n提提取取细细胞胞总总RNARNA或或mRNAmRNA直直接接进进行行电电泳泳分分离离。为为了了维维持持RNARNA的的单单链链状状态态，防防止止RNARNA形形成成发发夹夹结结构，在凝胶中需要加入变性剂。构，在凝胶中需要加入变性剂。n电电泳泳结结束束后后，直直接接采采用用毛毛细细管管虹虹吸吸法法将将凝凝胶胶中的中的RNARNA转移到纤维膜上与探针杂交。转移到纤维膜上与探针杂交。n3 3、应用：、应用：nNorthernNorthern杂杂交交技技术术用用于于检检测测各各种种基基因因转转录录产产物物的大小、转录量及

36、其变化。的大小、转录量及其变化。三三、原原位位杂杂交交（insituhybridization）n1、概念概念：n不改变核酸所在的位置，直接与探针杂交的方法。不改变核酸所在的位置，直接与探针杂交的方法。n2、种类、种类：n菌落原位杂交技术菌落原位杂交技术：用于鉴别阳性重组克用于鉴别阳性重组克隆细菌隆细菌。n细胞内和染色体原位杂交技术：细胞内和染色体原位杂交技术：用于用于观察察某些基因在某些基因在组织细胞中的表达状况和基因染色体胞中的表达状况和基因染色体定位定位 菌落原位杂交过程：菌落原位杂交过程：n用固相膜拓印培养菌落或噬菌斑，并做相应标记；用固相膜拓印培养菌落或噬菌斑，并做相应标记；n用碱液

37、处理拓膜菌落或噬菌斑，原位裂解释放用碱液处理拓膜菌落或噬菌斑，原位裂解释放DNA并固定；并固定；n进行预杂交、杂交和分析进行预杂交、杂交和分析。四、四、斑点及狭逢杂交斑点及狭逢杂交(dotblothybridization)n1、概念概念：n将核酸样品变性后直接点在硝酸纤维膜上，将核酸样品变性后直接点在硝酸纤维膜上，再与探针进行杂交。再与探针进行杂交。n斑点印迹为圆形，狭缝印迹是线状。斑点印迹为圆形，狭缝印迹是线状。n2、应用、应用：n用于分析细胞基因拷贝数的变化和基因转用于分析细胞基因拷贝数的变化和基因转录水平的变化。录水平的变化。 n用于鉴定阳性重组克隆，检测病原性微生用于鉴定阳性重组克隆

38、，检测病原性微生物和生物制品中的核酸污染状况物和生物制品中的核酸污染状况五、等位基因特异性寡核苷酸杂交五、等位基因特异性寡核苷酸杂交n等位基因特异性寡核苷酸杂交法（等位基因特异性寡核苷酸杂交法（ASOH）是最）是最早用于检测点突变的方法，也是目前广泛采用的早用于检测点突变的方法，也是目前广泛采用的基因诊断方法，由基因诊断方法，由Wallace于于1979年建立。年建立。n原理：原理：n人工设计一对等位基因特异性寡核苷酸探针人工设计一对等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO），长度），长度1520nt，两种探针序列只有一，两种探针序列只有一个碱基不同，该碱基对应突变碱基，因而一种探个碱基不同，该碱基

39、对应突变碱基，因而一种探针与正常基因序列完全互补，为正常探针；另一针与正常基因序列完全互补，为正常探针；另一种探针与突变基因序列完全互补，为突变探针。种探针与突变基因序列完全互补，为突变探针。例：诊断苯丙酮酸尿症（例：诊断苯丙酮酸尿症（PKU）n苯丙酮酸尿症是一种苯丙酮酸尿症是一种AR遗传，由于点突变遗传，由于点突变造成苯丙氨酸羟化酶（造成苯丙氨酸羟化酶（PHA）缺乏或不足）缺乏或不足引发此病。我国人群发病率为引发此病。我国人群发病率为1/16000.n人人PHA基因位于基因位于12q22-12q24.1，全长，全长90kb，其中包括，其中包括13个外显子，共编码个外显子，共编码451个氨基酸

40、。个氨基酸。n我们根据某个点突变位点，如我们根据某个点突变位点，如Arg243Gln，设计一对引物：设计一对引物：n正常探针：正常探针：TTCCGCCTCCGACCTGTn突变探针：突变探针：TTCCGCCTCCAACCTGTn杂交结果如下杂交结果如下第五节影响杂交的因素第五节影响杂交的因素n1.杂交温度杂交温度n影响杂交效率：当杂交温度比解链温度低影响杂交效率：当杂交温度比解链温度低2025时，时，DNA-DNA杂交效率最高。如果继续提高温度，杂交体将趋杂交效率最高。如果继续提高温度，杂交体将趋向于变性解链。向于变性解链。n影响核酸杂交的特异性。杂交温度越接近解链温度，碱基影响核酸杂交的特异

41、性。杂交温度越接近解链温度，碱基错配越少。当杂交温度比解链温度低错配越少。当杂交温度比解链温度低1015时，碱基错配时，碱基错配极少。在实际操作中，应当根据需要确定合适的杂交温度极少。在实际操作中，应当根据需要确定合适的杂交温度最适杂交温度。最适杂交温度。n2.离子强度和甲酰胺浓度离子强度和甲酰胺浓度n离子强度影响解链温度，因而影响最适杂交温度。在同一温离子强度影响解链温度，因而影响最适杂交温度。在同一温度下，降低离子强度可以减少碱基错配，但杂交缓慢；如果度下，降低离子强度可以减少碱基错配，但杂交缓慢；如果提高离子强度，杂交会加快，但碱基错配也随之增加。提高离子强度，杂交会加快，但碱基错配也随

42、之增加。n某些有机溶剂例如甲酰胺，也可以降低最适杂交温度。甲酰某些有机溶剂例如甲酰胺，也可以降低最适杂交温度。甲酰胺浓度每增加胺浓度每增加1%，最适杂交温度可以降低，最适杂交温度可以降低0.72。如果在杂。如果在杂交液中加入交液中加入30%50%的甲酰胺，其最适杂交温度能降到的甲酰胺，其最适杂交温度能降到3042。第五节影响杂交的因素第五节影响杂交的因素n3.探针种类和浓度探针种类和浓度n如果使用单链探针，杂交效率会随着探针浓度的增加而增加；如果使用单链探针，杂交效率会随着探针浓度的增加而增加；如果使用双链探针，探针浓度过高反而会影响杂交效率，因如果使用双链探针，探针浓度过高反而会影响杂交效率

43、，因为双链探针虽然在杂交前已经变性解链，但在最适杂交温度为双链探针虽然在杂交前已经变性解链，但在最适杂交温度下，探针很容易复性。下，探针很容易复性。n4.核酸分子大小和浓度核酸分子大小和浓度n核酸的浓度直接影响核酸链的碰撞几率，浓度越高，杂交越核酸的浓度直接影响核酸链的碰撞几率，浓度越高，杂交越快；核酸分子越大，其扩散速度越慢，并且越难以形成正确快；核酸分子越大，其扩散速度越慢，并且越难以形成正确配对，因而杂交越慢。配对，因而杂交越慢。n5.杂交时间杂交时间n如果其他条件都已经得到优化，杂交的效果就取决于杂交时如果其他条件都已经得到优化，杂交的效果就取决于杂交时间。如果杂交时间过短，杂交会不完

44、全；如果杂交时间过长，间。如果杂交时间过短，杂交会不完全；如果杂交时间过长，会产生非持异性杂交。一般将杂交时间控制在会产生非持异性杂交。一般将杂交时间控制在20小时左右。小时左右。第五节影响杂交的因素第五节影响杂交的因素n6.杂交促进剂杂交促进剂n惰性多聚体可以作为杂交促进剂，促进长度大于惰性多聚体可以作为杂交促进剂，促进长度大于250nt的探针的杂交。的探针的杂交。n硫酸葡聚糖和聚乙二醇是目前最常用的杂交促进剂，硫酸葡聚糖和聚乙二醇是目前最常用的杂交促进剂，但硫酸葡聚糖（但硫酸葡聚糖（dextransulfate）分子太大，会增）分子太大，会增加杂交液黏度；聚乙二醇（加杂交液黏度；聚乙二醇（

45、PEG）黏度低，价格低）黏度低，价格低廉，但在某些条件下会产生较强的本底。因此，使用廉，但在某些条件下会产生较强的本底。因此，使用杂交促进剂需要优化杂交条件。杂交促进剂需要优化杂交条件。n短的探针由于分子量小，复杂程度低，容易进行杂交，短的探针由于分子量小，复杂程度低，容易进行杂交，一般不使用杂交促进剂。一般不使用杂交促进剂。n7非特异性杂交非特异性杂交n在杂交前应当先进行预杂交，即用封闭物封闭非特异在杂交前应当先进行预杂交，即用封闭物封闭非特异性杂交位点，以减少其对探针的非特异性吸附。性杂交位点，以减少其对探针的非特异性吸附。第六节第六节基因芯片基因芯片n基因芯片（基因芯片（genechip

46、）也称为）也称为DNA芯片（芯片（DNAchip）、）、DNA微阵列（微阵列（DNAmicroarray）、寡）、寡核苷酸微阵列（核苷酸微阵列（oligonucleotidearray）等，是）等，是专门检测核酸的生物芯片。专门检测核酸的生物芯片。n原理：原理：n也是基于核酸分子杂交，属于固相杂交。所不同的是探针固相化、集成化；而待测样品被标记并且游离于液相基因芯片与固相杂交比较基因芯片与固相杂交比较一、基本原理和基本操作一、基本原理和基本操作n基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量检测检测DNA的技术。的技术。n（一）基本原理：（一）基本原理：n

47、先将大量已知序列的先将大量已知序列的DNA或或cDNA片段作为探针片段作为探针按照一定的阵列高密度固定于基片表面，这样阵按照一定的阵列高密度固定于基片表面，这样阵列中的每一个点实际上代表了一种特定基因，列中的每一个点实际上代表了一种特定基因，n然后与经过荧光标记的待测核酸进行杂交。然后与经过荧光标记的待测核酸进行杂交。n用专门仪器检测芯片上的杂交信号，经过计算机用专门仪器检测芯片上的杂交信号，经过计算机分析处理，获得待测核酸的各种信息。分析处理，获得待测核酸的各种信息。（二）基本操作（二）基本操作n1.芯片制作芯片制作n（1）原位合成法：）原位合成法：n原位合成法（原位合成法（insitusy

48、nthesis）是指直接在基片上合成）是指直接在基片上合成寡核苷酸。寡核苷酸。n光引导原位合成法，所用基片上带有由光敏保护基团保护光引导原位合成法，所用基片上带有由光敏保护基团保护的活性基团的活性基团n制作过程：制作过程：n用掩膜（用掩膜（mask）掩盖基片，只暴露特定区域，然后用）掩盖基片，只暴露特定区域，然后用光照除去暴露区域活性基团上的光敏保护基团，使活性基光照除去暴露区域活性基团上的光敏保护基团，使活性基团游离；团游离；n加入一种被同样的光敏保护基团保护的核苷酸，并化学加入一种被同样的光敏保护基团保护的核苷酸，并化学连接到游离的活性基团上。连接到游离的活性基团上。n重复上述步骤，最终制

49、成基因芯片重复上述步骤，最终制成基因芯片原位合成法原位合成法n（2）微量点样法：）微量点样法：n先制备寡核苷酸探针或先制备寡核苷酸探针或cDNA探针，再用专门的探针，再用专门的全自动点样仪按照一定顺序点印到基片表面，使全自动点样仪按照一定顺序点印到基片表面，使探针通过共价交联或静电吸附作用固定于基片上，探针通过共价交联或静电吸附作用固定于基片上，形成微阵列。形成微阵列。n点样主要有喷墨打印和接触打印两种方式。点样主要有喷墨打印和接触打印两种方式。喷墨打印法是利用压电晶体或其他技术将探针溶喷墨打印法是利用压电晶体或其他技术将探针溶液通过微孔喷射到基片表面，产生的液滴体积可液通过微孔喷射到基片表面

50、，产生的液滴体积可以在以在11092.5102l。接触打印法是用较为坚硬的点样针蘸取少量探针接触打印法是用较为坚硬的点样针蘸取少量探针溶液，然后接触基片，在基片表面留下探针斑点。溶液，然后接触基片，在基片表面留下探针斑点。斑点直径由点样针、探针溶液和基片表面的性质斑点直径由点样针、探针溶液和基片表面的性质共同决定。共同决定。n2样品制备样品制备n样品制备包括从组织细胞内分离纯化样品制备包括从组织细胞内分离纯化RNA和基因组和基因组DNA等样品、对样品进行扩增和等样品、对样品进行扩增和标记。标记。n标记物主要是荧光素和生物素等，其中以标记物主要是荧光素和生物素等，其中以荧光素最为常用。一般将待测

51、样品和对照荧光素最为常用。一般将待测样品和对照样品分别用样品分别用Cy3和和Cy5进行标记，这样与进行标记，这样与芯片杂交之后可以清楚地了解两种样品中芯片杂交之后可以清楚地了解两种样品中基因表达的异同。基因表达的异同。n扩增和标记可以采用逆转录反应和聚合酶扩增和标记可以采用逆转录反应和聚合酶链反应等。链反应等。n3分子杂交分子杂交n将杂交液滴到芯片上，或将芯片浸入杂交液中，将杂交液滴到芯片上，或将芯片浸入杂交液中，在一定条件下使待测在一定条件下使待测DNA与芯片探针阵列进行杂与芯片探针阵列进行杂交。杂交之后，用漂洗液漂洗芯片，除去末杂交交。杂交之后，用漂洗液漂洗芯片，除去末杂交的的DNA。n基

52、因芯片杂交的一个特点是反应体系内探针的含基因芯片杂交的一个特点是反应体系内探针的含量显著高于待测量显著高于待测DNA的含量，所以杂交信号的强的含量，所以杂交信号的强弱与待测弱与待测DNA的含量成正比。的含量成正比。n杂交条件将决定杂交结果的准确性。杂交条件包杂交条件将决定杂交结果的准确性。杂交条件包括杂交液的离子强度、杂交温度和杂交时间等。括杂交液的离子强度、杂交温度和杂交时间等。n在实际工作中，应根据探针的长度、类型、所带在实际工作中，应根据探针的长度、类型、所带电荷、电荷、G/C含量、芯片类型和研究目的等因素，含量、芯片类型和研究目的等因素，对杂交条件进行优化。对杂交条件进行优化。n4检测

53、分析检测分析n用芯片检测仪对芯片进行扫描处理，根据芯片上用芯片检测仪对芯片进行扫描处理，根据芯片上每个位点的探针序列即可知道待测每个位点的探针序列即可知道待测DNA的碱基序的碱基序列，从而获得待测列，从而获得待测DNA的信息。的信息。n检测结果一般可以获得三种阳性杂交图像：检测结果一般可以获得三种阳性杂交图像：nCy3（ex554nm，em568nm）标记的）标记的待测样品与芯片探针结合，形成红色杂交点，说待测样品与芯片探针结合，形成红色杂交点，说明待测样品中存在探针基因高表达；明待测样品中存在探针基因高表达；nCy5（ex652nm，em672nm）标记的）标记的对照样品与芯片探针结合，形成

54、绿色杂交点，说对照样品与芯片探针结合，形成绿色杂交点，说明对照样品中存在探针基因高表达；明对照样品中存在探针基因高表达；n两种待测两种待测DNA都与芯片探针结合，形成黄色杂都与芯片探针结合，形成黄色杂交点，说明两种样品中都存在探针基因高表达交点，说明两种样品中都存在探针基因高表达基因芯片技术分析基因表达基因芯片技术分析基因表达二、应用二、应用n1.DNA测序测序n应用基因芯片进行的应用基因芯片进行的DNA测序属于杂交测序（测序属于杂交测序（SBH）n基本原理是：基本原理是：n在芯片上固定一定长度寡核苷酸所有序列的探针，和待测在芯片上固定一定长度寡核苷酸所有序列的探针，和待测序序DNA杂交。从理

55、论上讲，任意待测杂交。从理论上讲，任意待测DNA序列都有相应序列都有相应探针与之杂交。根据杂交探针的重叠序列进行排列分析，探针与之杂交。根据杂交探针的重叠序列进行排列分析，即可确定待测即可确定待测DNA序列。序列。n例如，将含有全部例如，将含有全部8nt探针（探针（4865,536种）的芯片与一种）的芯片与一个个12nt的待测的待测DNA片段杂交之后，检测出有片段杂交之后，检测出有5个杂交位个杂交位点。将这点。将这5个杂交位点的探针按照其重叠序列进行排列，个杂交位点的探针按照其重叠序列进行排列，可以确定可以确定12nt序列为序列为AGCCTAGCTGAA12nt待测待测DNA序列为序列为AGC

56、CTAGCTGAAn2.基因表达研究基因表达研究n研究基因表达是目前基因芯片应用最多的一个领域。例如研究基因表达是目前基因芯片应用最多的一个领域。例如肿瘤细胞与正常细胞的基因表达存在着明显差异，涉及众肿瘤细胞与正常细胞的基因表达存在着明显差异，涉及众多基因的异常表达。应用基因芯片可以方便地揭示肿瘤细多基因的异常表达。应用基因芯片可以方便地揭示肿瘤细胞和正常细胞的基因表达在胞和正常细胞的基因表达在mRNA水平上的差异。应用水平上的差异。应用人类基因表达谱芯片人类基因表达谱芯片检测不同肿瘤细胞的基因表达差异，检测不同肿瘤细胞的基因表达差异，选择差异显著的基因作为肿瘤标志，可以对肿瘤进行分类选择差异

57、显著的基因作为肿瘤标志，可以对肿瘤进行分类和鉴定，从而建立一种新的肿瘤分类方法。和鉴定，从而建立一种新的肿瘤分类方法。n3.基因诊断基因诊断n基因芯片技术是基因诊断的核心技术，可以用于诊断肿瘤、基因芯片技术是基因诊断的核心技术，可以用于诊断肿瘤、遗传病、传染病，特别适合于产前诊断、群体筛查。目前遗传病、传染病，特别适合于产前诊断、群体筛查。目前已经成功开发有艾滋病病毒芯片已经成功开发有艾滋病病毒芯片可以诊断是否携带艾可以诊断是否携带艾滋病病毒滋病病毒HIV-1，p53芯片芯片可以分析患肿瘤的可能性，可以分析患肿瘤的可能性，P450芯片芯片可以诊断是否有药物代谢缺陷。可以诊断是否有药物代谢缺陷。

58、n4.用药个体化检测用药个体化检测n同一种药物对于不同患者在疗效和副作用方面会同一种药物对于不同患者在疗效和副作用方面会有很大差异，一定剂量的某种药物对甲患者有效，有很大差异，一定剂量的某种药物对甲患者有效，对乙患者却不起作用，对丙患者甚至会有副作用。对乙患者却不起作用，对丙患者甚至会有副作用。导致对药物反应个体差异的主要基础是导致对药物反应个体差异的主要基础是患者的遗患者的遗传学背景传学背景存在种族差异和个体差异，这种差异主存在种族差异和个体差异，这种差异主要体现在要体现在DNA的单核苷酸多态性（的单核苷酸多态性（SNP）上。基）上。基因芯片技术已经广泛用于分析单核苷酸多态性，因芯片技术已经

59、广泛用于分析单核苷酸多态性，可以在人的基因组中大规模筛选新的单核苷酸多可以在人的基因组中大规模筛选新的单核苷酸多态性。经过基因诊断之后，可以针对不同基因型态性。经过基因诊断之后，可以针对不同基因型采取不同的用药剂量，使临床用药个体化，降低采取不同的用药剂量，使临床用药个体化，降低药物的毒副作用，获得最佳疗效。药物的毒副作用，获得最佳疗效。n5.中药研究中药研究n由于中药具有多成分、多途径、多系统、多靶点的作用特由于中药具有多成分、多途径、多系统、多靶点的作用特点，用芯片技术研究中药优势巨大。基因组学及转录组学、点，用芯片技术研究中药优势巨大。基因组学及转录组学、DNA指纹图谱等在中药研究中的应

60、用都要利用基因芯片技指纹图谱等在中药研究中的应用都要利用基因芯片技术来完成。术来完成。n（1）药材鉴别：）药材鉴别：n利用基因芯片可以鉴定不同产地甚至不同季节药用植物利用基因芯片可以鉴定不同产地甚至不同季节药用植物/动动物的品种和质量。物的品种和质量。n（2）中药筛选：）中药筛选：n利用基因芯片可以分析给药前后基因表达谱的变化，分析利用基因芯片可以分析给药前后基因表达谱的变化，分析病理生理学原因，从中药成分中筛选先导化合物，大量减病理生理学原因，从中药成分中筛选先导化合物，大量减少动物实验和临床研究工作量，加快中药新药的研制步伐。少动物实验和临床研究工作量，加快中药新药的研制步伐。n（3）毒性评价：）毒性评价：n和其他药物一样，中药在发挥药效的同时也可能干扰细胞和其他药物一样，中药在发挥药效的同时也可能干扰细胞的正常代谢而具有毒副作用。基因芯片可以高通量分析药的正常代谢而具有毒副作用。基因芯片可以高通量分析药物对培养细胞或实验动物正常代谢的影响，从而在分子水物对培养细胞或实验动物正常代谢的影响，从而在分子水平评估药物的毒副作用，比传统的动物实验准确、快速、平评估药物的毒副作用，比传统的动物实验准确、快速、经济、省时。经济、省时。