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1、第四章第四章 固定化酶固定化酶n n一、固定化酶的概念一、固定化酶的概念n n二、固定化技术的兴起与开展二、固定化技术的兴起与开展n n三、酶和菌体的固定化方法三、酶和菌体的固定化方法n n四、固定化酶的特性四、固定化酶的特性n n复习题复习题一、固定化酶的概念一、固定化酶的概念n n固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶是是是是指指指指固固固固定定定定在在在在载载载载体体体体上上上上并并并并在在在在一一一一定定定定空空空空间间间间范范范范围围围围内内内内进进进进展展展展催催催催化化化化反响的酶。表示图反响的酶。表示图反响的酶。表示图反响的酶。表示图n n酶酶酶酶的的的的固固固固定定定定化化化化是是
2、是是指指指指经经经经过过过过某某某某种种种种方方方方式式式式将将将将酶酶酶酶和和和和水水水水不不不不溶溶溶溶性性性性载载载载体体体体相相相相结结结结合合合合，使使使使酶酶酶酶被被被被集集集集中中中中和和和和限限限限制制制制，从从从从而而而而在在在在运运运运用用用用时时时时不不不不再再再再分分分分散散散散。固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶具具具具有有有有稳稳稳稳定定定定性性性性添添添添加加加加、可可可可反反反反复复复复运运运运用用用用并并并并易易易易于于于于和和和和产产产产物物物物分分分分开开开开等等等等优优优优点点点点，抑抑抑抑制了游离酶的缺乏之处。制了游离酶的缺乏之处。制了游离酶的缺乏之处。
3、制了游离酶的缺乏之处。n n固固固固定定定定化化化化所所所所用用用用的的的的酶酶酶酶可可可可以以以以是是是是经经经经提提提提取取取取分分分分别别别别后后后后得得得得到到到到的的的的一一一一定定定定纯纯纯纯度度度度的的的的酶酶酶酶，也也也也可可可可以以以以是是是是结结结结合合合合在在在在菌菌菌菌体体体体死死死死细细细细胞胞胞胞或或或或细细细细胞胞胞胞碎碎碎碎片片片片上上上上的的的的酶酶酶酶或或或或酶酶酶酶系系系系。相相相相应应应应地地地地，前前前前者者者者称称称称为为为为固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶，后后后后者者者者称称称称为为为为固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体或或或或固固固固定定
4、定定化化化化死死死死细细细细胞胞胞胞。可可可可见见见见，固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体是是是是固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶的的的的一一一一种种种种方方方方式式式式，它它它它不不不不像像像像固固固固定定定定化化化化活活活活细细细细胞胞胞胞或或或或称称称称固固固固定定定定化化化化增增增增殖殖殖殖细细细细胞胞胞胞那那那那样样样样，固固固固定定定定化化化化菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。菌体的细胞为死细胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。 固定化酶表示图固定化酶表示
5、图水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶固定化酶固定化酶固定化技术固定化技术二、固定化技术的兴起与开展二、固定化技术的兴起与开展n n一生物催化剂一生物催化剂酶的显著优点酶的显著优点n n二游离酶的缺乏之处二游离酶的缺乏之处n n三固定化酶的开展简史三固定化酶的开展简史一生物催化剂一生物催化剂酶的显著优点酶的显著优点n n酶酶酶酶是是是是生生生生物物物物催催催催化化化化剂剂剂剂，它它它它具具具具有有有有特特特特异异异异、高高高高效效效效、反反反反响响响响条条条条件件件件温温温温暖暖暖暖、副副副副反反反反响响响响少少少少等等等等显显显显著著著著优优优优点点点点，因因因因此此
6、此此随随随随着着着着酶酶酶酶学学学学研研研研讨讨讨讨的的的的不不不不断断断断深深深深化化化化和和和和酶酶酶酶工工工工程程程程的的的的开开开开展展展展，工工工工业业业业化化化化消消消消费费费费的的的的酶酶酶酶越越越越来来来来越越越越多多多多，酶酶酶酶的的的的运运运运用用用用也也也也越越越越来来来来越越越越广广广广泛泛泛泛。如如如如今今今今酶酶酶酶在在在在食食食食品品品品、化化化化工工工工、医医医医药药药药、农农农农业业业业、环环环环保保保保、能能能能源源源源和和和和科科科科研研研研等等等等各各各各个个个个领领领领域域域域已已已已获获获获得得得得了了了了显显显显著著著著的的的的效效效效果果果果。酶
7、酶酶酶作作作作为为为为生生生生物物物物催催催催化化化化剂剂剂剂的的的的许许许许多优点是任何无机催化剂无法比较的。多优点是任何无机催化剂无法比较的。多优点是任何无机催化剂无法比较的。多优点是任何无机催化剂无法比较的。 二游离酶的缺乏之处二游离酶的缺乏之处n n1 1 1 1酶酶酶酶的的的的稳稳稳稳定定定定性性性性差差差差，这这这这是是是是酶酶酶酶的的的的最最最最大大大大的的的的弱弱弱弱点点点点。酶酶酶酶的的的的化化化化学学学学本本本本质质质质是蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。是蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。是蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。是蛋白
8、质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。n n2 2 2 2难难难难于于于于延延延延续续续续化化化化消消消消费费费费。酶酶酶酶普普普普通通通通都都都都是是是是在在在在水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中催催催催化化化化反反反反响响响响，与与与与底底底底物物物物和和和和产产产产物物物物混混混混合合合合在在在在反反反反响响响响系系系系统统统统中中中中，反反反反响响响响后后后后酶酶酶酶仍仍仍仍有有有有较较较较高高高高的的的的活活活活力力力力却却却却不不不不易易易易回回回回收收收收利利利利用用用用。这这这这种种种种一一一一次次次次性性性性运运运运用用用用酶酶酶酶的的的的方方方方式式式式，导导导导致致致
9、致本本本本钱钱钱钱较较较较高高高高和难以延续化消费。和难以延续化消费。和难以延续化消费。和难以延续化消费。n n3 3 3 3终终终终产产产产品品品品的的的的分分分分别别别别提提提提纯纯纯纯困困困困难难难难。由由由由于于于于酶酶酶酶反反反反响响响响后后后后成成成成为为为为杂杂杂杂质质质质与与与与产产产产物物物物混混混混在在在在一一一一同同同同，无无无无疑疑疑疑给给给给进进进进一一一一步步步步的的的的分分分分别别别别纯纯纯纯化化化化带带带带来来来来一一一一定定定定的的的的困困困困难难难难。针针针针对酶的以上缺乏，改善的方法之一就是固定化技术的运用。对酶的以上缺乏，改善的方法之一就是固定化技术的运
10、用。对酶的以上缺乏，改善的方法之一就是固定化技术的运用。对酶的以上缺乏，改善的方法之一就是固定化技术的运用。 三固定化酶的开展简史三固定化酶的开展简史n n1916191619161916年年年年NelsonNelsonNelsonNelson和和和和GriffinGriffinGriffinGriffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧化就曾经将转化酶吸附在炭和氧化就曾经将转化酶吸附在炭和氧化就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝上，并且证明这种吸附的酶即固定化酶具有活性。铝上，并且证明这种吸附的酶即固定化酶具有活性。铝上，并且证明这种吸附的酶即固定化酶具有活性。铝上，并且证明这种吸附的酶即固定化酶具有活
11、性。n n1953195319531953年，年，年，年，GrubhoferGrubhoferGrubhoferGrubhofer和和和和SchleithSchleithSchleithSchleith采用聚氨基苯乙烯树脂为采用聚氨基苯乙烯树脂为采用聚氨基苯乙烯树脂为采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。酶、核糖核酸酶等结合，制成
12、了固定化酶。酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。n n1969196919691969年，日本的千畑一郎初次在工业消费规模运用固定化年，日本的千畑一郎初次在工业消费规模运用固定化年，日本的千畑一郎初次在工业消费规模运用固定化年，日本的千畑一郎初次在工业消费规模运用固定化氨基酰化酶从氨基酰化酶从氨基酰化酶从氨基酰化酶从DLDLDLDL氨基酸延续消费氨基酸延续消费氨基酸延续消费氨基酸延续消费LLLL氨基酸，消费本钱仅氨基酸，消费本钱仅氨基酸，消费本钱仅氨基酸，消费本钱仅为游离酶消费本钱的为游离酶消费本钱的为游离酶消费本钱的为游离酶消费本钱的60%60%60%60%左右，他开创了固定化酶运用于延左
13、右，他开创了固定化酶运用于延左右，他开创了固定化酶运用于延左右，他开创了固定化酶运用于延续化工业消费的先例，是酶运用史上的伟大变革。续化工业消费的先例，是酶运用史上的伟大变革。续化工业消费的先例，是酶运用史上的伟大变革。续化工业消费的先例，是酶运用史上的伟大变革。n n1971197119711971年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化酶的一致英文名为酶的一致英文名为酶的一致英文名为酶的一致英文名为Immobilized EnzymeImmobil
14、ized EnzymeImmobilized EnzymeImmobilized Enzyme。n n1973197319731973年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞延续化消年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞延续化消年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞延续化消年，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞延续化消费费费费LLLL天冬氨酸，后来又开展到固定化增殖细胞即固定化活天冬氨酸，后来又开展到固定化增殖细胞即固定化活天冬氨酸，后来又开展到固定化增殖细胞即固定化活天冬氨酸，后来又开展到固定化增殖细胞即固定化活细胞。细胞。细胞。细胞。三、酶和菌体的固定化方法三、酶和菌体的固定化方法n n一吸
15、附法一吸附法 n n二包埋法二包埋法 n n三结合法三结合法 n n四交联法四交联法 n n五热处置法五热处置法 n n各固定方法的特点与比较各固定方法的特点与比较n n酶固定化方法表示图酶固定化方法表示图酶固定化方法表示图酶固定化方法表示图酶固定化方法表示图酶固定化方法表示图一吸附法一吸附法n n概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶概念：吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其外表上而使酶固定化的方法。菌体吸附在其外表上而使酶固定化的方法。菌体吸附在其外表上而使酶固定化的方法。菌体吸附在
16、其外表上而使酶固定化的方法。n n吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。n n特点：最大的优点是廉价简便、条件温暖酶活损失特点：最大的优点是廉价简便、条件温暖酶活损失特点：最大的优点是廉价简便、条件温暖酶活损失特点：最大的优点是廉价简便、条件温暖酶活损失少；最大的缺陷是酶易从载体上解吸附。少；最大的缺陷是酶易从载体上解吸附。
17、少；最大的缺陷是酶易从载体上解吸附。少；最大的缺陷是酶易从载体上解吸附。 二包埋法二包埋法n n概概概概念念念念：包包包包埋埋埋埋法法法法是是是是指指指指将将将将酶酶酶酶或或或或含含含含酶酶酶酶菌菌菌菌体体体体包包包包埋埋埋埋在在在在各各各各种种种种多多多多孔孔孔孔载体中而使酶固定化的方法。载体中而使酶固定化的方法。载体中而使酶固定化的方法。载体中而使酶固定化的方法。n n分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：n n凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法n n半透膜包埋法
18、半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜包埋法n n特特特特点点点点：优优优优点点点点是是是是条条条条件件件件温温温温暖暖暖暖，缺缺缺缺陷陷陷陷是是是是只只只只适适适适于于于于底底底底物物物物和和和和产产产产物物物物都是小分子的酶的固定化。都是小分子的酶的固定化。都是小分子的酶的固定化。都是小分子的酶的固定化。 凝胶包埋法凝胶包埋法n n概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶概念：凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是内部的
19、微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截留法。留法。留法。留法。n n凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶凝胶种类：所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡两类
20、。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。树脂等。树脂等。树脂等。 半透膜包埋法半透膜包埋法n n半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分子聚合构成的小球内的方法。由于半透膜子聚合构成的小球内的方法。由于半透膜包埋法所构成的固定化酶小球的直径普通包埋法所构成的固定化酶小球的直径普通只需几微米到几百微米，称为微胶囊，所只需几微米到几百微米，称为微胶囊，所以，半透膜包埋法也称为微胶囊包埋
21、法。以，半透膜包埋法也称为微胶囊包埋法。 三结合法三结合法n n概概念念：结结合合法法是是指指经经过过离离子子键键或或共共价价键键将将酶与载体结合在一同而使酶固定化的方法。酶与载体结合在一同而使酶固定化的方法。n n分类：分类：离子键结合法离子键结合法 n n 共价键结合法共价键结合法 离子离子键结合法合法n n载载 体体 ： 常常 用用 的的 载载 体体 有有 DEAEDEAE纤纤 维维 素素 、TEAETEAE纤纤维维素素、DEAEDEAE葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶等等离离子子交换剂。交换剂。n n特特点点：与与吸吸附附法法类类似似，具具有有酶酶活活损损失失少少、结结合合力力弱弱等等特特点点，在
22、在pHpH值值和和离离子子强强度度等等条条件件改改动动时时，酶酶易易解解吸吸，所所以以运运用用时时需需求求严严厉控制厉控制pHpH值和离子强度等条件。值和离子强度等条件。 共价共价键结合法合法n n载载载载体体体体：常常常常用用用用的的的的载载载载体体体体有有有有纤纤纤纤维维维维素素素素、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、甲甲甲甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。n n主主主主要要要要步步步步骤骤骤骤：首首首首先先先先在
23、在在在载载载载体体体体上上上上引引引引入入入入一一一一活活活活泼泼泼泼基基基基团团团团使使使使载载载载体体体体活活活活化化化化，然然然然后后后后使使使使该该该该活活活活泼泼泼泼基基基基团团团团与与与与酶酶酶酶分分分分子子子子中中中中的的的的某某某某一一一一基基基基团团团团反反反反响响响响，构构构构成成成成共共共共价价价价键键键键。酶酶酶酶分分分分子子子子中中中中可可可可以以以以构构构构成成成成共共共共价价价价键键键键的的的的基基基基团团团团有有有有氨氨氨氨基基基基、羧羧羧羧基基基基、巯巯巯巯基基基基、羟羟羟羟基基基基、酚基和咪唑基等。酚基和咪唑基等。酚基和咪唑基等。酚基和咪唑基等。n n特特特
24、特点点点点：最最最最大大大大优优优优点点点点是是是是酶酶酶酶结结结结合合合合结结结结实实实实，但但但但本本本本钱钱钱钱较较较较高高高高，而而而而且且且且需需需需求求求求留留留留意意意意防防防防止止止止酶酶酶酶活活活活性性性性中中中中心心心心上上上上的的的的基基基基团团团团被被被被偶偶偶偶联联联联而而而而引引引引起起起起酶酶酶酶的的的的失失失失活活活活，或或或或酶酶酶酶在在在在与与与与载载载载体体体体偶偶偶偶联联联联后后后后能能能能够够够够发发发发生生生生活活活活性性性性中中中中心心心心构构构构象象象象的的的的变变变变化化化化而而而而影影影影响响响响催催催催化化化化才才才才干干干干酶活回收率普通
25、为酶活回收率普通为酶活回收率普通为酶活回收率普通为30%30%30%30%左右。左右。左右。左右。 四交联法四交联法n n概概概概念念念念：采采采采用用用用双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂将将将将酶酶酶酶分分分分子子子子衔衔衔衔接接接接起起起起来来来来，从从从从而而而而使使使使酶酶酶酶固固固固定定定定化化化化的方法，称为交联法。的方法，称为交联法。的方法，称为交联法。的方法，称为交联法。n n双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂：常常常常用用用用的的的的有有有有戊戊戊戊二二二二醛醛醛醛、己己己己二二二二胺胺胺胺、顺顺顺顺丁丁丁丁烯烯烯烯二二二二酸酸酸酸酐酐酐酐和和和和双双双双偶偶偶
26、偶氮氮氮氮苯苯苯苯等等等等。双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂分分分分子子子子中中中中含含含含有有有有两两两两个个个个官官官官能能能能团团团团，这这这这两两两两个个个个官官官官能能能能团团团团可可可可与与与与酶酶酶酶或或或或蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的某某某某些些些些基基基基团团团团反反反反响响响响，从从从从而而而而使使使使酶酶酶酶分分分分子子子子之之之之间间间间或或或或蛋蛋蛋蛋白质分子之间发生交联。白质分子之间发生交联。白质分子之间发生交联。白质分子之间发生交联。n n运用范围：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。运用范围：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。运用范围：不仅适用
27、固定化酶，也可用于固定化菌体。运用范围：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。n n特特特特点点点点：用用用用交交交交联联联联法法法法制制制制备备备备的的的的固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶或或或或固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体，其其其其最最最最突突突突出出出出的的的的特特特特点点点点是是是是结结结结合合合合结结结结实实实实而而而而酶酶酶酶活活活活损损损损失失失失大大大大。但但但但是是是是尽尽尽尽能能能能够够够够地地地地降降降降低低低低交交交交联联联联剂剂剂剂浓浓浓浓度和缩短反响时间将有利于固定化酶活力的提高。度和缩短反响时间将有利于固定化酶活力的提高。度和缩短反响时间将有利于固定化
28、酶活力的提高。度和缩短反响时间将有利于固定化酶活力的提高。n n双双双双重重重重固固固固定定定定法法法法：为为为为了了了了各各各各方方方方法法法法之之之之间间间间可可可可以以以以取取取取长长长长补补补补短短短短，常常常常采采采采用用用用双双双双重重重重固固固固定定定定法法法法，例例例例如如如如可可可可将将将将交交交交联联联联法法法法与与与与一一一一些些些些物物物物理理理理性性性性的的的的方方方方法法法法如如如如吸吸吸吸附附附附法法法法、包包包包埋埋埋埋法法法法结结结结合合合合运运运运用用用用，从从从从而而而而制制制制备备备备出出出出酶酶酶酶活活活活损损损损失失失失少少少少、结结结结合合合合结结
29、结结实实实实的的的的固固固固定定定定化酶或固定化菌体。化酶或固定化菌体。化酶或固定化菌体。化酶或固定化菌体。 五热处置法五热处置法n n概概概概念念念念：此此此此法法法法是是是是用用用用于于于于菌菌菌菌体体体体固固固固定定定定化化化化的的的的一一一一种种种种方方方方法法法法。它它它它是是是是将将将将含含含含酶酶酶酶的的的的细细细细胞胞胞胞直直直直接接接接进进进进展展展展热热热热处处处处置置置置将将将将酶酶酶酶固固固固定定定定在在在在菌菌菌菌体体体体内内内内从从从从而而而而获得固定化菌体的方法。获得固定化菌体的方法。获得固定化菌体的方法。获得固定化菌体的方法。n n特特特特点点点点：菌菌菌菌体体
30、体体本本本本身身身身既既既既是是是是酶酶酶酶供供供供体体体体同同同同时时时时也也也也是是是是载载载载体体体体，所所所所以以以以方方方方法法法法简简简简便便便便。但但但但需需需需留留留留意意意意的的的的是是是是，热热热热处处处处置置置置睬睬睬睬引引引引起起起起酶酶酶酶的的的的热热热热变变变变性性性性失失失失活活活活，因因因因此此此此，该该该该法法法法只只只只适适适适用用用用于于于于目目目目的的的的酶酶酶酶热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性较较较较好好好好时时时时，而而而而且且且且进进进进展展展展热热热热处处处处置置置置时时时时还还还还需需需需严严严严厉厉厉厉控控控控制制制制好好好好热热热热处处处处
31、置置置置强强强强度度度度，即即即即严严严严厉厉厉厉把把把把握握握握加加加加热热热热温温温温度度度度和和和和时时时时间间间间。热热热热处处处处置置置置法法法法也也也也可可可可与与与与其其其其它它它它固固固固定化方法配合运用，进展双重固定化。定化方法配合运用，进展双重固定化。定化方法配合运用，进展双重固定化。定化方法配合运用，进展双重固定化。 以以以以上上上上四四四四种种种种固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶方方方方法法法法各各各各有有有有其其其其优优优优缺缺缺缺陷陷陷陷见见见见表表表表4-14-1。往往往往往往往往一一一一种种种种酶酶酶酶可可可可以以以以用用用用不不不不同同同同方方方方法法法法固固
32、固固定定定定化化化化，但但但但没没没没有有有有一一一一种种种种固固固固定定定定化化化化方方方方法法法法可可可可以以以以普普普普遍遍遍遍地地地地适适适适用用用用于于于于每每每每一一一一种种种种酶酶酶酶。在在在在实实实实践践践践运运运运用用用用时时时时，常常常常将将将将两两两两种种种种或或或或数数数数种种种种固定化方法并用，以取长补短。固定化方法并用，以取长补短。固定化方法并用，以取长补短。固定化方法并用，以取长补短。各固定方法的特点与比较各固定方法的特点与比较四、四、 固定化酶的特性固定化酶的特性一固定化酶的外形一固定化酶的外形二固定化酶的性质二固定化酶的性质三酶活力三酶活力四固定化酶的稳定性四
33、固定化酶的稳定性五固定化酶的反响特性五固定化酶的反响特性一固定化酶的外形一固定化酶的外形n n固固定定化化酶酶的的方方式式多多样样，依依不不同同用用途途有有颗颗粒粒、线线条条、薄膜和酶管等外形。其中颗粒占绝大多数。薄膜和酶管等外形。其中颗粒占绝大多数。n n颗颗粒粒和和线线条条主主要要用用于于工工业业发发酵酵消消费费，如如装装成成酶酶柱柱用用于延续消费，或在反响器中进展批式搅拌反响；于延续消费，或在反响器中进展批式搅拌反响；n n薄膜主要用于酶电极，运用于分析化学；薄膜主要用于酶电极，运用于分析化学；n n酶管机械强度较大，亦宜用于工业消费。酶管机械强度较大，亦宜用于工业消费。 二固定化酶的性
34、质二固定化酶的性质n n酶酶在在水水溶溶液液中中以以自自在在的的游游离离形形状状存存在在，但但是是固固定定后后酶酶分分子子便便从从游游离离的的形形状状变变为为结结实实地地结结合合于于载载体体的的形形状状，其其结结果果往往往往引引起起酶酶的的性性质质的的改改动动。为为此此，在在固固定定化化酶酶的的运运用用过过程程中中，必必需需了了解解固固定定化化酶酶的的性性质质与与游游离离酶酶之之间间的的差差别别，并并对对操操作作条条件件加加以以适适当调整。当调整。n n由由于于固固定定化化的的方方法法不不同同，固固定定化化酶酶的的活活力力和和性性质质也有所不同。也有所不同。三酶活力三酶活力n n固固固固定定定
35、定化化化化酶酶酶酶的的的的活活活活力力力力在在在在多多多多数数数数情情情情况况况况下下下下比比比比天天天天然然然然酶酶酶酶的的的的活活活活力力力力低低低低，其其其其缘缘缘缘由由由由能能能能够是：够是：够是：够是：n n酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；n n酶酶酶酶与与与与载载载载体体体体结结结结合合合合时时时时，其其其其高高高高级级级级构构构构造造造造发发发发生生生生了了了了变变变变化化化化，其其其其构构构构象象象象的的的的改改改改动动
36、动动导致了酶与底物结合才干或催化底物转化才干的改动；导致了酶与底物结合才干或催化底物转化才干的改动；导致了酶与底物结合才干或催化底物转化才干的改动；导致了酶与底物结合才干或催化底物转化才干的改动；n n酶酶酶酶被被被被固固固固定定定定化化化化后后后后，虽虽虽虽不不不不失失失失活活活活，但但但但酶酶酶酶与与与与底底底底物物物物间间间间的的的的相相相相互互互互作作作作用用用用遭遭遭遭到到到到空间位阻的影响。空间位阻的影响。空间位阻的影响。空间位阻的影响。n n也也也也有有有有在在在在个个个个别别别别情情情情况况况况下下下下，酶酶酶酶经经经经固固固固定定定定化化化化后后后后其其其其活活活活力力力力升
37、升升升高高高高，能能能能够够够够是是是是由由由由于于于于固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游离酶活力高。固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游离酶活力高。固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游离酶活力高。固定化后酶的抗抑才干提高使得它反而比游离酶活力高。四固定化酶的稳定性四固定化酶的稳定性 n n游离酶的一个突出缺陷是稳定性差，而固定化酶的稳定性普游离酶的一个突出缺陷是稳定性差，而固定化酶的稳定性普游离酶的一个突出缺陷是稳定性差，而固定化酶的稳定性普游离酶的一个突出缺陷是稳定性差，而固定化酶的稳定性普通都比游离酶提高很多，这对酶的运用是非常有利的。其稳通都比游离酶提高很多，这对酶的运用是非常
38、有利的。其稳通都比游离酶提高很多，这对酶的运用是非常有利的。其稳通都比游离酶提高很多，这对酶的运用是非常有利的。其稳定性加强主要表如今如下几个方面：定性加强主要表如今如下几个方面：定性加强主要表如今如下几个方面：定性加强主要表如今如下几个方面：n n1 1 1 1操作稳定性操作稳定性操作稳定性操作稳定性n n2 2 2 2贮藏稳定性贮藏稳定性贮藏稳定性贮藏稳定性n n3 3 3 3热稳定性热稳定性热稳定性热稳定性n n4 4 4 4对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性n n5 5 5 5酸碱稳定性酸碱稳定性酸碱稳定性酸碱稳定性酶酶酶酶的的的的固固固固定定定定化化化化
39、方方方方法法法法不不不不同同同同，所所所所得得得得的的的的固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶的的的的操操操操作作作作稳稳稳稳定定定定性性性性亦亦亦亦有有有有差差差差别别别别。固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶在在在在操操操操作作作作中中中中可可可可以以以以长长长长时时时时间间间间保保保保管管管管活活活活力力力力，普普普普通通通通情情情情况况况况下下下下，半半半半衰衰衰衰期期期期在在在在一一一一个个个个月月月月以以以以上上上上，即有工业运用价值。即有工业运用价值。即有工业运用价值。即有工业运用价值。固固固固定定定定化化化化可可可可延延延延伸伸伸伸酶酶酶酶的的的的贮贮贮贮藏藏藏藏有有有有效效效效期期期
40、期。但但但但长长长长期期期期贮贮贮贮藏藏藏藏，活活活活力力力力也也也也难难难难免免免免下下下下降降降降，最最最最好好好好能能能能立立立立刻刻刻刻便便便便用用用用。假假假假设设设设贮贮贮贮藏藏藏藏条条条条件件件件比比比比较较较较好好好好，亦亦亦亦可可可可较较较较长长长长时时时时间间间间坚坚坚坚持持持持活活活活力力力力。例例例例如如如如，固固固固定定定定化化化化胰胰胰胰蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶，在在在在0.0025mol/L0.0025mol/L磷磷磷磷酸酸酸酸缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中，于于于于2020保保保保管管管管数数数数月月月月，活活活活力力力力尚尚尚尚不损失。不损失。不损失。不损失
41、。热稳定性对工业运用非常重要。大多数酶在热稳定性对工业运用非常重要。大多数酶在热稳定性对工业运用非常重要。大多数酶在热稳定性对工业运用非常重要。大多数酶在固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也有一些酶的耐热性反而下降。普通采用吸附有一些酶的耐热性反而下降。普通采用吸附有一些酶的耐热性反而下降。普通采用吸附有一些酶的耐热性反而下降。普通采用吸附法来进展酶的固定化时，有时会导致酶热稳法来进展酶的固定化时，有时会导致酶热稳法来进展酶的固定化时，有时会导致酶热稳法来进展酶的固定化时，有时会
42、导致酶热稳定性的降低。定性的降低。定性的降低。定性的降低。酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这能够是由于蛋白酶是大分酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这能够是由于蛋白酶是大分酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这能够是由于蛋白酶是大分酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这能够是由于蛋白酶是大分子，由于遭到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一子，由于遭到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一子，由于遭到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一子，由于遭到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶
43、包埋的固定化天门郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑
44、制剂的耐受性也得到了提高。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定pHpH范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，能够是范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，能够是范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，能够是范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，能够是由于固定化过程使酶活性构象的敏感区遭到牵连而由于固定化过程使酶活性构象的敏感区遭到牵连而由于固定化过程使酶活性构象的敏感区遭到牵连而由于固定化过程使酶活性构象的敏感区遭到牵连
45、而导致的。导致的。导致的。导致的。五固定化酶的反响特性五固定化酶的反响特性n n固定化酶的反响特性，均与游离酶有所不同。固定化酶的反响特性，均与游离酶有所不同。n n1 1、底物特异性、底物特异性 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系。有一定关系。n n 1 1酶的底物为小分子化合物酶的底物为小分子化合物 n n 2 2酶的底物为大分子化合物酶的底物为大分子化合物n n2 2、反响的最适、反响的最适pHpHn n3 3、反响的最适温度、反响的最适温度n n4 4、米氏常数、米氏常数n n5 5、最大反响速度、最大反响速度1酶的底物为小分子化合物
46、普普通通来来说说，当当酶酶的的底底物物为为小小分分子子化化合合物物时时，固固定定化化酶酶的的底底物物特特异异性性大大多多数数情情况况下下不不发发生生变变化化。例例如如，氨氨基基酰酰化化酶酶、葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶、葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶等等，固固定定化化前前后后的的底底物物特异性没有变化。特异性没有变化。2酶的底物为大分子化合物酶的底物为大分子化合物n n当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会
47、发生变化。这是由二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。这是由于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接于载体引起的空间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进展催化反响，酶的催化活力难以发扬出来，催化近而无法进展催化反响，酶的催化活力难以发扬出来，催化近而无法进展催化反响，酶的催化活力难以发扬出来，催化近而无法进展催化反响，酶的催化活力难以发扬出来，催化活性大大下降
48、；而分子量较小的底物遭到空间位阻作用的影活性大大下降；而分子量较小的底物遭到空间位阻作用的影活性大大下降；而分子量较小的底物遭到空间位阻作用的影活性大大下降；而分子量较小的底物遭到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。响较小，与游离酶没有显著区别。响较小，与游离酶没有显著区别。响较小，与游离酶没有显著区别。n n酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，普通随着底物分子量的增大，固定物特异性的影响也不
49、同，普通随着底物分子量的增大，固定物特异性的影响也不同，普通随着底物分子量的增大，固定物特异性的影响也不同，普通随着底物分子量的增大，固定化酶的活力下降。例如，糖化酶用化酶的活力下降。例如，糖化酶用化酶的活力下降。例如，糖化酶用化酶的活力下降。例如，糖化酶用CMCCMC叠氮衍生物固定化时，叠氮衍生物固定化时，叠氮衍生物固定化时，叠氮衍生物固定化时，对分子量对分子量对分子量对分子量80008000的直链淀粉的活性为游离酶的的直链淀粉的活性为游离酶的的直链淀粉的活性为游离酶的的直链淀粉的活性为游离酶的7777，而对分，而对分，而对分，而对分子量为子量为子量为子量为5050万的直链淀粉的活性只需万的
50、直链淀粉的活性只需万的直链淀粉的活性只需万的直链淀粉的活性只需15%15%1717。2、反响的最适、反响的最适pH酶酶酶酶被被被被固固固固定定定定后后后后，其其其其最最最最适适适适pHpH和和和和pHpH曲曲曲曲线线线线常常常常会会会会发发发发生生生生偏偏偏偏移移移移，缘由：缘由：缘由：缘由：酶本身电荷在固定化前后发生变化；酶本身电荷在固定化前后发生变化；酶本身电荷在固定化前后发生变化；酶本身电荷在固定化前后发生变化；载载载载体体体体电电电电荷荷荷荷性性性性质质质质致致致致使使使使固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶分分分分子子子子内内内内外外外外分分分分散散散散层层层层的的的的氢氢氢氢离子浓度产
51、生差别；离子浓度产生差别；离子浓度产生差别；离子浓度产生差别；酶酶酶酶催催催催化化化化反反反反响响响响产产产产物物物物导导导导致致致致固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶分分分分子子子子内内内内部部部部构构构构成成成成带带带带电电电电荷微环境。荷微环境。荷微环境。荷微环境。3、反响的最适温度固固定定化化酶酶的的最最适适反反响响温温度度多多数数较较游游离离酶酶高高，如如色色氨氨酸酸酶酶经经共共价价结结合合后后最最适适温温度度比比固固定定前前提提高高5 51515，但但也也有有不不变变甚甚至至降降低低的的。固固定定化化酶酶的的作作用用最最适适温温度度会会受受固固定定化化方方法法以及固定化载体的影响。以
52、及固定化载体的影响。4、米氏常数n n米氏常数Km反映了酶与底物的亲和力。酶经固定化后，酶蛋白分子的高级构造的变化以及载体电荷的影响可导致底物和酶的亲合力的变化。运用载体结合法制成的固定化酶Km有时变动的缘由，主要是由于载体与底物间的静电相互作用的缘故。5、最大反响速度 固定化酶的最大反响速度与游离酶大多数是一固定化酶的最大反响速度与游离酶大多数是一样的。有些酶的最大反响速度会因固定化方法样的。有些酶的最大反响速度会因固定化方法的不同而有所差别。的不同而有所差别。复习题n n一、什么叫固定化酶？酶的固定化方法有哪些？其根本概念分别是什么？n n二、酶固定化后，其性质能否有变化？都有哪些规律性变化？
