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1、实验三实验三 药敏药敏实验内容实验内容l一、纸片分散法K-B法l二、稀释法 (MIC)实验目的实验目的l一、掌握纸片分散法的原理、操作方法、结果的判别及其临床意义。l二、掌握纸片分散法的质量控制(采用规范菌株控制可变要素)。l三、掌握肉汤稀释法抗生素敏感性实验的原理、操作方法、结果判别及临床意义。l四、了解稀释法的质量控制(采用规范菌株控制可变要素)。纸片分散法纸片分散法K-B法法l器材与试剂l 菌种： 金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培育物，调整浓度至0.5麦氏比浊管相当于1.5108CFU/ml)；或挑新颖培育的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至
2、0.5麦氏比浊管。l 培育基：水解酪蛋白培育基MH琼脂。l 其他：无菌棉签、抗菌纸片、镊子、直尺等。l原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物汲取琼脂中的水分溶解，不断向纸片周围区域分散，构成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，构成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。l方法方法:4人一人一组，2人做金葡菌人做金葡菌规范种，范种，2人做人做临床种，每种菌床种，每种菌选4个不同的个不同的药物物纸片片l 1、制、制备MH琼脂平板：将加脂平板：将加热融化的融化的琼脂脂冷却至冷却至60左右左右时倾注于直径注于直径为9cm的无菌平
3、的无菌平板中，使板中，使琼脂厚度脂厚度为4mm，待，待琼脂凝固后运脂凝固后运用，如有冷凝水用，如有冷凝水产生，可放置生，可放置37 温箱中温箱中15-30分分钟后运用。后运用。l 2、无菌棉、无菌棉签蘸取菌液，在蘸取菌液，在试管内壁旋管内壁旋转挤去多余菌液后在平板外表均匀涂布接种去多余菌液后在平板外表均匀涂布接种3次，次，每次旋每次旋转平板平板60，最后沿平板，最后沿平板內缘涂布涂布1周。周。l 3、平板在室温下枯燥、平板在室温下枯燥5分分钟，用无菌，用无菌镊子将子将抗菌抗菌药物物纸片片贴于于琼脂外表，各脂外表，各纸片中心相距片中心相距大于大于24mm，距平板，距平板內缘大于大于15mm， 3
4、7 温箱中孵育温箱中孵育16-18小小时，量取抑菌圈直径。，量取抑菌圈直径。l结果察看中的本卷须知：l 1、准确量取抑菌圈直径，假设抑菌圈为椭圆形，量其最长径和最短径，取其平均值。l 2、假设出现双层抑菌圈，普通药物丈量内圈，而磺胺类药物那么量其外圈。l 3、假设抑菌圈内有散在菌落出现，排除污染菌的存在和其他影响要素，假设无污染菌等，需重做。l结果察看：果察看：l1、结果解果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照书上的上的规范判范判读结果。按敏感果。按敏感S、中介、中介I、耐、耐药R报告。告。l 例如：抗菌例如：抗菌药物丁胺卡那霉素物丁胺卡那霉素AMK，每，每张纸片片
5、含含药量量30微克，抑菌圈微克，抑菌圈14mm为耐耐药，15-16mm为中中介，介，17mm为敏感。敏感。l2、质量控制：量控制：规范菌株的抑菌圈范菌株的抑菌圈应落在落在书上的上的预期范期范围内，假内，假设超出超出该范范围，应为失控，而不失控，而不发报告，告，应及及时查找找缘由，予以由，予以纠正。正。l 例如：抗菌例如：抗菌药物丁胺卡那霉素物丁胺卡那霉素AMK，每，每张纸片片含含药量量30微克，金黄色葡萄球菌微克，金黄色葡萄球菌ATCC规范株的抑菌圈范株的抑菌圈应在在20-26mm之之间。l思索题：l 影响要素？l 1、培育基的质量：双层抑菌圈的出现？l 2、纸片质量l 3、接种细菌的菌量l
6、4、孵育的温度和时间l 5、操作要素稀释法稀释法l微量稀释法l常量稀释法试管稀释法常量稀释法试管稀释法常量稀释法试管稀释法1、实验目的： 用于丈量某种药物对测试菌的最小抑菌浓度MIC2、实验原理： 将抗菌药物混合于肉汤中作一系列的稀释，再参与定量的测试菌，经一定时间和温度培育后，无细菌生长的最低药物浓度即为该药对此菌的MIC。定量的测试菌的制备定量的测试菌的制备l1、将金黄色葡萄球菌ATCC25923和金黄色葡萄球菌临床种的6小时肉汤培育物，调整浓度至0.5麦氏比浊管相当于1.5108CFU/ml)；或挑新颖培育的单个菌落，在无菌生理盐水中研磨，校正其浓度至0.5麦氏比浊管。l2、将调好浊度的
7、菌液用无菌肉汤稀释10倍，即可运用。步骤和方法步骤和方法l将抗菌药物用肉汤稀释成不同浓度，参与定量测试菌。l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9对照l 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1l mll 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去l (80单位l 稀释的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1l ml) 37培育16-18小时l l结果察看:l完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为该抗菌药对此菌的MIC。l此次实验即为青霉素对金黄色葡萄球菌ATCC株和临床株的MIC。l结果举例：l编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9l 无菌肉汤管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1l mll 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 弃去l (80单位l 金葡菌 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1l结果l 细菌生长 - - - - - + + + +l青霉素浓度 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 0.0625 对照- l结果判别:抑制肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对检测菌的MICl影响要素？临床意义？
