实验八凝胶过滤法分离蛋白质 二．原理二．原理分子筛层析分子筛层析molecular-sieve chromatography凝胶过滤层析凝胶过滤层析gel-filtration chromatography分子排阻层析分子排阻层析molecular exclusion chromatographyØ凝凝胶胶具具有有网网状状结结构构，，小小分分子子物物质质能能进进入入其其内内部部，，而而大大分分子子物物质质却却被被排排除除在在外外部部当当混混合合溶溶液液过过凝凝胶胶过过滤滤层层析析柱柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开时，溶液中的物质按不同分子量筛分开 凝胶过滤介质凝胶过滤介质Ø不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构多孔的网状结构Ø常用凝胶：常用凝胶： 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶）和琼脂糖凝胶（（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）Ø凝胶因交联度不同凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小孔径不同，交联度越大，孔径越小Ø蛋白质分子直径蛋白质分子直径 > 凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。
径者则进入凝胶 交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（Sephadex））Ø葡聚糖和葡聚糖和3-氯氯-1，，2环氧丙烷以醚键相互交联形成环氧丙烷以醚键相互交联形成Ø按交联度大小分按交联度大小分8种型号，种型号，G值代表不同交联度值代表不同交联度Ø Sephadex G-10，，15，，25，，50，，75，，100，，150，，200Ø数字表示每克干胶膨胀时吸水量的数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水克代表每克干胶膨胀时可以吸水克 蠕动泵蠕动泵记录仪记录仪部分收集器部分收集器梯度制造仪梯度制造仪层析柱层析柱检测仪检测仪洗脱液洗脱液 G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；分离相对分子量小的物质； G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离相对分子量大的物质；Ø 分离范围分离范围Mr（肽（肽和球蛋白）和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000 Sephadex G –50 1500-30000Sephadex G –75 3000-70000 凝胶过滤层析特点凝胶过滤层析特点Ø设备简单，操作方便设备简单，操作方便Ø分离条件温和，样品回收率高分离条件温和，样品回收率高（（100%））Ø实验重复性好实验重复性好 除盐除盐Ø选择孔径小，交联度大的凝胶。
选择孔径小，交联度大的凝胶ØSephadex G-25 全排出的最小分子量为全排出的最小分子量为5000 ØSephadex G –50 全排出的最小分子量为全排出的最小分子量为30000 （除盐的蛋白质分子量必须大于（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的，消除凝胶对蛋白质的滞留作用滞留作用Ø当分子量未知时，选择当分子量未知时，选择Sephadex G-25 Ø洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离用葡萄糖凝胶流出，结果使大小不同的物质分离用葡萄糖凝胶G-25或或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短过柱的办法除盐，所用的时间就比较短Ø 用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图对洗脱体积作图 三、器材与试剂三、器材与试剂Ø1×20cm层析柱、自动部分收集器，蠕动泵层析柱、自动部分收集器，蠕动泵Ø葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex-50Ø蒸馏水蒸馏水Ø 三角铁架三角铁架Ø 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液蓝色葡聚糖溶液(200万）万）Ø6mg/ml细胞色素细胞色素C溶液溶液 （几万）（几万） 样品混合液样品混合液Ø2mg/ml重铬酸钾溶液（几百）重铬酸钾溶液（几百） 四、实验操作四、实验操作1、凝胶溶胀、凝胶溶胀Ø取取Sephadex G-50 15g，加，加500ml蒸馏水室温溶胀一天蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀（或沸水浴中溶胀1h）。
Ø待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止无细颗粒为止 Ø不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使流不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使流速下降和分离效果降低速下降和分离效果降低 实验操作实验操作2、装柱、装柱u取取1×20cm层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水蒸馏水(赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡)，在蒸馏，在蒸馏水高度约占层析柱高水高度约占层析柱高1/3时，关闭下端出口（用橡皮筋）时，关闭下端出口（用橡皮筋）u自顶部缓缓加入自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cmu用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面不能让凝胶表面露出水面)。
u装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整 Ø3、加样：、加样：Ø取取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素细胞色素C溶液、溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各重铬酸钾溶液各6滴混合滴混合--------上柱样品上柱样品Ø打开下端出口，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平打开下端出口，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓（不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面缓地加到床表面( 不要使平整的床表面搅动不要使平整的床表面搅动)Ø打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，关闭下端出口关闭下端出口Ø滴加蒸馏水使凝胶柱上端有滴加蒸馏水使凝胶柱上端有2cm水柱水柱 实验操作实验操作 4、洗脱和收集、洗脱和收集 Ø打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蠕动泵流速，打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蠕动泵流速，流速流速0.33ml/min (3分钟分钟1ml，不能让凝胶表面露出水面，不能让凝胶表面露出水面)。
Ø设置部分收集器参数，每设置部分收集器参数，每3分钟收集分钟收集1管Ø取小试管取小试管20支，每管收集支，每管收集1ml，观察三种颜色出现的管号，，观察三种颜色出现的管号，用用+，，-或或5，，4，，3，，2，，1，，0数字表示颜色深浅数字表示颜色深浅实验操作实验操作 5、绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线Ø实验操作实验操作543210 凝胶再生和保存凝胶再生和保存ØSephadex，，Sepharose-----多糖，微生物多糖，微生物----酶酶--------水解糖苷键水解糖苷键Ø各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌-----冰箱（冰点以上）冰箱（冰点以上）保存数月保存数月Ø防腐剂：防腐剂：0.02%叠氮化钠叠氮化钠Ø高压蒸汽灭菌：，高压蒸汽灭菌：，30分钟分钟 五、注意事项五、注意事项Ø接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液漏液Ø装柱要均匀，不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压装柱要均匀，不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压紧凝胶但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，紧凝胶但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。
凝胶床高度下降Ø始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干Ø绢布、塑料密封圈绢布、塑料密封圈 。