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1、第三章第三章 植物细胞和动物细胞植物细胞和动物细胞培养反应器培养反应器第一节第一节 植物细胞培养反应器植物细胞培养反应器 植植物物细细胞胞培培养养：是是指指在在离离体体条条件件下下将将愈愈伤伤组组织织或或其其他他易易分分散散的的组组织织置置于于液液体体培培养养基基中中，将将组组织织振振荡荡分分散散成成游游离离的的悬悬浮浮细细胞胞，通通过过继继代代培培养养使使细细胞胞增增殖殖来来获获得得大大量量细细胞胞群体的方法。群体的方法。表表1植物细胞培养和从完整的植物植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产紫草宁的比较生产方式生产方式收获时间收获时间紫草宁浓度紫草宁浓度（%干重）干重）完整植物完整植
2、物2-3年年1-2植物细胞培植物细胞培养养21天天14一、植物细胞培养过程的特点一、植物细胞培养过程的特点1 1、培养液中植物细胞的特性、培养液中植物细胞的特性植物细胞比微生物细胞大植物细胞比微生物细胞大植植物物细细胞胞通通常常以以细细胞胞数数在在2-2002-200之之间间、直直径径为为2mm2mm左右的非均相集合细胞团方式存在左右的非均相集合细胞团方式存在植物细胞抗剪能力弱植物细胞抗剪能力弱2 2、细胞培养液的流变学性质、细胞培养液的流变学性质n植植物物细细胞胞培培养养液液的的粘粘度度随随着着细细胞胞浓度的增加而显著上升浓度的增加而显著上升 3 3、植物细胞培养过程中的氧传递、植物细胞培养
3、过程中的氧传递所所有有植植物物细细胞胞都都是是好好气气性性的的，需需要要连连续续不断地供氧。不断地供氧。二二氧氧化化碳碳的的浓浓度度对对细细胞胞的的生生长长也也相相当当重重要要。4 4、泡沫和表面粘附性、泡沫和表面粘附性 气泡较大，覆盖有蛋白质和粘多糖，气泡较大，覆盖有蛋白质和粘多糖，粘性大，易粘附于培养液表面以上的器粘性大，易粘附于培养液表面以上的器壁上壁上5 5、悬浮细胞的生长与增殖、悬浮细胞的生长与增殖细胞数量随时间的变化曲线呈现细胞数量随时间的变化曲线呈现“S”“S”形。形。 细胞生长经历：延迟期、对数生细胞生长经历：延迟期、对数生长期、直线生长期、减慢期和静止期。长期、直线生长期、减
4、慢期和静止期。6 6、悬浮培养的优点、悬浮培养的优点增加培养细胞与培养液的接触面增加培养细胞与培养液的接触面及时带走培养物产生的有害代谢产及时带走培养物产生的有害代谢产物物保证了氧的充分供应保证了氧的充分供应二二 、植物细胞培养反应器、植物细胞培养反应器培养方式：培养方式：悬浮培养和固定化细胞培养悬浮培养和固定化细胞培养 1 1、悬浮培养生物反应器、悬浮培养生物反应器(1)机械搅拌式反应器机械搅拌式反应器 优优点点: :是是能能够够获获得得较较高高的溶氧系数。的溶氧系数。 缺点缺点: :剪切力大。剪切力大。2 2、固定化细胞生物反应器、固定化细胞生物反应器（1 1）填充床生物反应器）填充床生物
5、反应器 特特点点：细细胞胞固固定定于于支支撑撑物物表表面面或或内内部部，支支撑撑物物颗颗粒粒堆堆叠叠成成床床，培培养养基基在床层间流动。在床层间流动。 优点：单位体积固定细胞量大。优点：单位体积固定细胞量大。 缺缺点点: :混混合合效效果果差差，使使溶溶氧氧、pHpH、温度控制、气体的排出较难。温度控制、气体的排出较难。 （2 2）流化床生物反应器）流化床生物反应器特特点点：利利用用流流体体的的能能量量来来悬悬浮颗粒。浮颗粒。 优点：优点：小颗粒传质特性良好。小颗粒传质特性良好。 缺缺点点：剪剪切切力力和和颗颗粒粒碰碰撞撞会会损坏固定化细胞。损坏固定化细胞。 （3）膜生物反应器）膜生物反应器中
6、空纤维反应器中空纤维反应器螺线式卷绕反应器螺线式卷绕反应器中中空空纤纤维维反反应应器器：细细胞胞保保留留在在管管外外，基基质走管内质走管内螺螺旋旋式式卷卷绕绕反反应应器器：将将固固定定有有细细胞胞的的膜膜卷成圆柱状卷成圆柱状优优点点：可可重重复复使使用用，可可以以采采用用较较厚厚的的细细胞层胞层缺点缺点: : 投资大投资大第二节第二节 动物细胞培养反应器动物细胞培养反应器 动物细胞培养的产物举例动物细胞培养的产物举例 疫苗疫苗小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗、风疹疫苗苗、风疹疫苗单克隆抗体单克隆抗体IgG、IgM、IgA等等免疫调节剂免疫调
7、节剂细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺素素酶酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶激素激素生长激素、促红细胞生成素生长激素、促红细胞生成素一一 、 动物细胞培养过程的特点动物细胞培养过程的特点n动物细胞培养定义动物细胞培养定义将动物组织或细胞从机体取出，分散成将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的条件，模拟体内单个细胞，给予必要的条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。1 1、动物细胞与微生物细胞的性质比较动物细胞与微生物细胞的性质比较性性质质动动物物
8、细细胞胞微生物微生物细细胞胞大小大小代代谢调节谢调节方式方式营营养要求养要求生生长长速率速率机械机械强强度度环环境适境适应应性性10-100um内部和激素内部和激素苛刻苛刻倍增倍增时间时间一般一般为为12-60h很差，缺乏保很差，缺乏保护护性性细细胞壁胞壁差差10um内部内部宽宽松，可利用多种底物松，可利用多种底物倍增倍增时间时间一般一般为为0.5-2h较较好好好好表表 动物细胞与微生物细胞的性质比较动物细胞与微生物细胞的性质比较 2 、 动物细胞与微生物细胞的培养方法比较动物细胞与微生物细胞的培养方法比较性性质质动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞PH控制控制搅搅拌速度拌速度溶氧控制溶氧控制
9、培养基培养基灭灭菌方法菌方法培养培养时间时间对对水水纯纯度的要求度的要求CO2HCO3缓缓冲液冲液较较慢慢改改变进变进入气体的氧入气体的氧浓浓度度过滤过滤几天几天3、4周周很高很高添加酸、碱添加酸、碱速度快、范速度快、范围围广广改改变搅变搅拌速度拌速度、通气量等、通气量等高温蒸煮高温蒸煮几小几小时时几天几天较较低低表表 动物细胞与微生物细胞的培养方法比较动物细胞与微生物细胞的培养方法比较 二、动物细胞培养方法二、动物细胞培养方法n贴壁培养贴壁培养n悬浮培养悬浮培养n固定化培养固定化培养n 1.1.贴壁培养贴壁培养是是指指必必须须贴贴附附在在固固体体介介质质表表成上生长成上生长 的细胞培养。的细
10、胞培养。2. 2. 悬浮培养悬浮培养 是是指指细细胞胞在在培培养养器器中中自自由由悬悬浮浮生生长长的的过过程。程。 3.3.固定化培养固定化培养 是是既既适适用用于于贴贴壁壁依依赖赖性性细细胞胞，又又适适用用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。三、细胞培养的操作方式三、细胞培养的操作方式培养方式分为：培养方式分为：分批式分批式流加式流加式半连续式半连续式连续式连续式灌注式灌注式1 1、 分批式培养分批式培养分分批批式式培培养养：指指先先将将细细胞胞和和培培养养液液一一次次性性装装入入反反应应器器内内进进行行培培养养，细细胞胞不不断断生生长长，产产物物不不断断形形
11、成，经一段时间后，终止培养。成，经一段时间后，终止培养。特点：特点：分批式培养过程的环境随时间变化很大分批式培养过程的环境随时间变化很大细细胞胞的的生生长长阶阶段段可可分分为为延延滞滞期期、对对数数生生长长期期、减速期、平稳期和衰退期。减速期、平稳期和衰退期。(3)在分批培养过程中在分批培养过程中, ,与细胞的生长与细胞的生长、代代 谢相关的主要参数有谢相关的主要参数有n细胞密度及其比生长速率细胞密度及其比生长速率n限制性营养物质及其比消耗速率限制性营养物质及其比消耗速率n产物浓度及其比生长速率产物浓度及其比生长速率n抑制物浓度抑制物浓度2 2、流加式培养、流加式培养特点：特点：u可避免某种营
12、养成分的初始浓度过高；可避免某种营养成分的初始浓度过高；u能防止营养成分在培养过程中被耗尽；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；u整个过程反应体积是变化的。整个过程反应体积是变化的。 培养过程各参数的变化可写为：培养过程各参数的变化可写为：d（VX）/ dt = uVX V-培养液的体积；培养液的体积； X-为为t时间时的细胞密度；时间时的细胞密度； u-为细胞的比生长为细胞的比生长流加方式：流加方式：(1)(1)无反馈控制流加无反馈控制流加 (2) (2)反馈控制流加反馈控制流加3 3、半连续式培养、半连续式培养 指指在在分分批批式式培培养养的的基基础础上上，将将分分批批培培养养的的培培养养液
13、液部部分分取取出出，并并补补充充加加入入等等量量的的新新鲜鲜培培养养基基，使使反反应应器内培养液的总体积保持不变。器内培养液的总体积保持不变。4 4、连续式培养、连续式培养n连连续续式式培培养养：使使反反应应条条件件处处于于一一种种恒定状态。恒定状态。n特特点点：细细胞胞所所处处环环境境条条件件长长时时间间地地稳定稳定5 5、灌注培养、灌注培养灌灌注注培培养养：是是把把细细胞胞接接种种后后进进行行培培养养，新新鲜鲜的的培培养养液液从从反反应应器器一一头头不不断断加加入入，从从另另一一头头不不断断取取出出等等量量的的培培养养液液，细细胞胞仍仍留留在在反反应应器器内内，使使细细胞胞处处于于一一种种
14、营营养养不不断的状态。断的状态。特点：特点：高密度培养动物细胞高密度培养动物细胞图（生化生产工艺学P221）三、动物细胞大规模培养反应器三、动物细胞大规模培养反应器1、通气搅拌式细胞培养反应器、通气搅拌式细胞培养反应器工作原理工作原理:反应器运转反应器运转时，圆筒以时，圆筒以30-60r/min30-60r/min的速度转动，由于离心的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流外沿下降，形成循环流
15、动。在气腔内气体由分动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到气体成分均匀地分布到反应器内。反应器内。反应器的优缺点反应器的优缺点优点：避免向培养基优点：避免向培养基直接通气时气泡损直接通气时气泡损伤细胞，没有移动伤细胞，没有移动部件，密封好，氧部件，密封好，氧转换率较高，便于转换率较高，便于放大。放大。 缺点：氧传递系数小，缺点：氧传递系数小，气路系统不能就地气路系统不能就地灭菌。灭菌。 反应器适用范围反应器适用范围 悬浮培养：非贴壁依
16、赖性细胞悬浮培养：非贴壁依赖性细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞2 2、气升式动物细胞培养反应器、气升式动物细胞培养反应器与与微微生生物物发发酵酵及及植植物物细细胞胞培培养养的的反反应器结构相同。应器结构相同。优点优点:器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便于器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。 3 3、中空纤维细胞培养反应器、中空纤维细胞培养反应器1 1）结构）结构2 2）用途）用途 : :培养悬浮生长的细胞和贴壁依赖性细胞培养悬浮生长的细胞和贴壁依赖性细胞 3)3)优点优点培养器体积小，细胞密
17、度高；培养器体积小，细胞密度高；浓缩产品；浓缩产品；产物纯度高；产物纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。自动化程度高，细胞生长周期长。4)4)缺点缺点: :价格高价格高 (1)(1)优点优点培养器体积小，细胞密度高；培养器体积小，细胞密度高；浓缩产品；浓缩产品；产物纯度高；产物纯度高；自自动动化化程程度度高高，细细胞胞生生长长周周期期长。长。(2)(2)缺点缺点: :价格高价格高 4 4、微载体悬浮培养系统、微载体悬浮培养系统 微微载载体体悬悬浮浮培培养养定定义义：用用微微珠珠作作载载体体， 使使单单层层动动物物细细胞胞生生长长于于微微珠珠表表面面，可可在在培养液中进行悬浮培养。培养液中进行
18、悬浮培养。 微载体：微载体：贴壁培养动物细胞的载体微珠。贴壁培养动物细胞的载体微珠。 反应器反应器: :可用与悬浮培养相同设备可用与悬浮培养相同设备 优点：优点：比表面积大；生长条件易控制比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。取样方便；易于分离。 微载体悬浮培养反应器应解决的问题：微载体悬浮培养反应器应解决的问题： 搅拌适度，剪切应力小；搅拌适度，剪切应力小； 能满足细胞所需的溶氧浓度；能满足细胞所需的溶氧浓度； 能严格控制能严格控制PHPH值。值。 微载体悬浮培养优点：微载体悬浮培养优点： 比表面积大；生长条件易控制
19、且易放大，兼贴比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。 5 5、微囊培养系统、微囊培养系统微囊技术微囊技术：将生物活性物质、完整的活细胞或将生物活性物质、完整的活细胞或组织包在薄的半透膜内。组织包在薄的半透膜内。微囊制作：微囊制作：将活性细胞悬浮于海藻酸钠溶液中将活性细胞悬浮于海藻酸钠溶液中将活性细胞悬浮液按一定的液滴大小滴入氯化钙将活性细胞悬浮液按一定的液滴大小滴入氯化钙溶液中形成含活细胞的凝胶小珠溶液中形成含活细胞的凝胶小珠用半透膜材料包被，制成半透性外膜用半透膜材料包被，制成半透性外膜6 6、大载体系统培养、
20、大载体系统培养大载体：大载体：由海藻酸钠构成由海藻酸钠构成大载体制作：大载体制作：配制配制50mmol/L 50mmol/L 氯化钙溶液氯化钙溶液将活性细胞悬浮于低粘度的海藻酸钠凝胶中混匀将活性细胞悬浮于低粘度的海藻酸钠凝胶中混匀按适宜速度喷珠于氯化钙溶液中按适宜速度喷珠于氯化钙溶液中抽出氯化钙溶液，用生理盐水洗抽出氯化钙溶液，用生理盐水洗2 2次次第三节第三节 微藻培养反应器微藻培养反应器 一、微藻生物技术的优越性一、微藻生物技术的优越性1 1、光能利用率高；光能利用率高；2 2、易收获和加工；易收获和加工；3 3、商品价值高；商品价值高；4 4、繁殖快。繁殖快。二、微藻在规模培养过程中的特
21、点二、微藻在规模培养过程中的特点1 1、光照充足，、光照充足，PHPH、温度合适，无机碳源充足；、温度合适，无机碳源充足；2 2、强化二氧化碳的吸收和大量氧气的排出；、强化二氧化碳的吸收和大量氧气的排出；3 3、混合效果好；、混合效果好；4 4、避免污染；、避免污染；5 5、设备防腐蚀性好。、设备防腐蚀性好。三、三、 微藻大规模培养反应器微藻大规模培养反应器( (一一) ) 敞开式敞开式 ( (二二) ) 封闭式封闭式封闭式光生物反应器主要类型封闭式光生物反应器主要类型管式、板式以及一些其他特殊类型管式、板式以及一些其他特殊类型1 1、管式光生物反应器管式光生物反应器1 1）水平放置地面的蛇形
22、管式光生物反应器水平放置地面的蛇形管式光生物反应器 用用有有机机玻玻璃璃为为材材料料制制作作，管管道道平平行行排排列水平放置于地面。列水平放置于地面。 2）浸没在水中冷却的管式生物反应器）浸没在水中冷却的管式生物反应器反反应应器器的的管管道道材材料料是是聚聚乙乙烯烯塑塑料料, ,集集光光管放在水池中管放在水池中 3)3) 气升式内环流光生物反应器气升式内环流光生物反应器 反应器由气升管道、下降管、除气室、在线反应器由气升管道、下降管、除气室、在线检测与控制系统，光照、热交换和供气系统组成。检测与控制系统，光照、热交换和供气系统组成。 4 4）管道式循环磁处理光生物反应器）管道式循环磁处理光生物
23、反应器（教材）（教材） 用有机玻璃或透明塑料制作用有机玻璃或透明塑料制作 2 2、管式光生物反应器开发设计的主要发展趋势、管式光生物反应器开发设计的主要发展趋势1 1）管径减小并稳定在一定范围内）管径减小并稳定在一定范围内2 2）集光管的排列向空间发展）集光管的排列向空间发展3 3）降低管路阻力提高藻液流速）降低管路阻力提高藻液流速4 4）普遍采用气升循环混合系统）普遍采用气升循环混合系统 3 3、板式光生物反应器、板式光生物反应器1）水平放置的板式光生物反应器水平放置的板式光生物反应器 这这种种反反应应器器由由具具有有三三层层壁壁的的单单元元板板组组 合合而而成成, ,单单元元板板的内部结构
24、与空心瓦的内部结构类似。的内部结构与空心瓦的内部结构类似。 2 2）浅层溢流板式光生物反应器）浅层溢流板式光生物反应器反应器由多个平行的板组成反应器由多个平行的板组成4 4、 板式光生物反应器的发展趋势板式光生物反应器的发展趋势1 1）板式光生物反应器板面趋向于空间立体放置。）板式光生物反应器板面趋向于空间立体放置。2 2）板式光生物反应器光路长度向宽的方向发展）板式光生物反应器光路长度向宽的方向发展。思考题思考题 1 1、比比较较植植物物、动动物物、微微生生物物细细胞胞的的结结构构和和生生理理特特点。点。2 2、描描述述植植物物细细胞胞、动动物物细细胞胞生生物物反反应应器器的的共共性性。各有何优缺点。各有何优缺点。3 3、你你认认为为最最适适合合于于植植物物细细胞胞、动动物物细细胞胞培培养养的的生生物物反反应应器器、培培养养方方法法及及操操作作方方式式，并并说说明明其其理理由。由。
