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1、 史史 娟娟医科院基础所医科院基础所 新科研楼新科研楼607607E-mail: E-mail: 细胞凋亡和细胞自噬细胞凋亡和细胞自噬12Outline1.Historyofapoptosisresearch2.Characterizationofapoptosis3.PhysiologicalSignificances4.ApoptosisSignalingPathways5.RegulationofApoptosis6.ApoptosisandAutophagy3第一节第一节 凋亡的研究历史凋亡的研究历史1842CarlVogetInitialobservationthatcelldeat
2、hinpartofnormaldevelopment1972Kerr,WyllieandCurrie-introducedtermapoptosistodescribecelldeathwithasetofcommonmorphologicalfeatures-Celldeletionwascontrolledunderphysiologicalconditionsinadults-Deregulationcouldleadtomanydiseases-MorphologicallyidenticaltodevelopmentalCDanddistinctfromaccidentalcelld
3、eath41980WyllieBiochemicalchangesinapoptoticmorphology:-DNAfragmentation-Requiresexpressionofdeathgenes1988Bcl-2wasfoundtobeanti-apoptotic1991cedgeneswereidentifiedinC.elegan1992Fas/APO-1/CD95wasidentified1993Aroleofp53inregulationofapoptosiswasdescribedFasligandwasidentifiedICEwasfoundtobehomologof
4、ced-3inmammalianIAPswereidentified1994Theroleofmitochondriaduringapoptosis1996TheroleofcaspasesduringapoptosisReleaseofcytochromecfrommitochondriaduringapoptosiswasdiscovered1997Apafswereidentified5 NobelPrize2002inPhysiologyandMedicine SydneyBrennerJohnE.SulstonRobertH.Horvitzfor their discoveries
5、concerninggenetic regulation of organ development and programmed cell death6“GeneticcontrolofprogrammedcelldeathinthenematodeCaenorhabditiselegans”“Youcanobservealotbywatching.”Y.Berra7第二节第二节 凋亡细胞的特征凋亡细胞的特征 8凋亡凋亡(apoptosis)(apoptosis)的形态学特征为染色质凝集、边的形态学特征为染色质凝集、边缘化，细胞皱缩，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸外翻，缘化，细胞皱缩，细胞膜内侧的磷
6、脂酰丝氨酸外翻，细胞出泡形成凋亡小体。细胞凋亡受到一系列相关细胞出泡形成凋亡小体。细胞凋亡受到一系列相关基因的严格调控。基因的严格调控。程序性细胞死亡（程序性细胞死亡（programmed cell deathprogrammed cell death，PCDPCD），），即是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身即是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，主动结束其生命的过程，这种死亡由基因的程序，主动结束其生命的过程，这种死亡由基因决定的。大多数程序性细胞死亡，呈现细胞凋亡的决定的。大多数程序性细胞死亡，呈现细胞凋亡的形态学特征。形态学特征。9NecrosisApoptosis1
7、0细胞凋亡与细胞坏死在形态上的主要区别细胞凋亡 细胞坏死发生条件 多为生理性 病理性（偶然刺激） 单个细胞丢失 成群细胞死亡细胞膜 发泡，完整 破裂，不完整细胞器 结构保留 破坏细胞核 核凝集断裂 核破碎溶解 染色质均一浓缩细胞 皱缩形成凋亡小体 细胞膨胀而溶解 被邻近正常和巨噬细胞吞噬 残余碎片被巨噬细胞吞噬炎症反应 无，不释放内容物 有，释放内容物11细胞凋亡与细胞坏死在生物化学方面的主要区别细胞凋亡 细胞坏死基因调节 由凋亡相关基因调控 与基因调控无关发生条件 多为生理性 病理性（偶然刺激） 能量 需要能量 不需要能量新的基因转录 有 无大分子合成 需要 不需要Caspase 依赖性 不
8、依赖DNA 降解为180-200bp DNA随机性降解成为任意 的整数倍的DNA Ladder 长度的片段细胞膜 磷脂酰丝氨酸外翻12Morphology of Apoptotic Cell13ApoptosisNecrosisApoptosis Apoptosis VS.VS. Necrosis Necrosis1415第三节第三节 细胞凋亡的生理学细胞凋亡的生理学 病理学意义病理学意义 16保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。维持内环境稳定：清除衰老细
9、胞、维持内环境稳定：清除衰老细胞、DNADNA损伤的细胞等。损伤的细胞等。如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话，就会干扰内环境稳定。话，就会干扰内环境稳定。防御功能：清除被病原体感染的细胞等。防御功能：清除被病原体感染的细胞等。生理学意义生理学意义17保证个体正常发育：蝌蚪成蛙、昆虫蜕变、淋巴细胞阳性和阴性选择、表皮和指（趾）甲的形成等。18 Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis.Tissue remodeling. 19脊椎动物的神经系统的发育20C
10、TL杀伤靶细胞。21免疫细胞凋亡免疫细胞凋亡细胞凋亡:95%的细胞凋亡 胸腺细胞成熟过程中的凋亡 阳性选择 阴性选择激活诱导的细胞凋亡：（activation-induced cell death，AICD）CTL诱导靶细胞的凋亡： 穿孔素介导的靶细胞凋亡 Fas介导的靶细胞凋亡 22lymphoidprogenitor(CLP)doublenegative(DN)doublepositive(DP)Apoptosis and survival during T lymphocyte development23Apoptosis and survival during B lymphocyte
11、 development24物理因素：物理因素：X-X-射线、热休克等；射线、热休克等；化学因素：过氧化氢、乙醇、化学因素：过氧化氢、乙醇、8 8氯腺苷、氨氯腺苷、氨 甲蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯碱等；甲蝶呤、苯丁酸氮芥、三尖杉酯碱等；生物因素：某些细胞因子表达水平变化、蛋白分生物因素：某些细胞因子表达水平变化、蛋白分 子的激活、修饰、降解或构象改变、子的激活、修饰、降解或构象改变、 活性氧的产生等。活性氧的产生等。ApoptosisInducers25 病原体侵染；病原体侵染；诱导凋亡诱导凋亡HIVHIV抑制凋亡抑制凋亡PoxvirusPoxvirus细胞凋亡不足细胞凋亡不足肿瘤，自身免疫疾
12、病；肿瘤，自身免疫疾病；细胞凋亡过度细胞凋亡过度神经退行性疾病（神经退行性疾病（ADAD，帕金森症）、心肌梗塞、，帕金森症）、心肌梗塞、 再生再生障碍性贫血、骨组织坏死。障碍性贫血、骨组织坏死。病理学意义病理学意义26HIVinfectioncausesapoptosis27接受凋亡信号接受凋亡信号蛋白水解酶（蛋白水解酶（caspasescaspases）的活化）的活化凋亡的级联反应凋亡的级联反应凋亡调控分子间的相互作用凋亡调控分子间的相互作用第四节第四节 细胞凋亡的信号传递细胞凋亡的信号传递28细胞外部刺激信号介导的死亡受体信号细胞外部刺激信号介导的死亡受体信号传递途径传递途径( (extr
13、insicextrinsic) )细胞内部的信号传递途径细胞内部的信号传递途径 ( (intrinsic or mitochondrial)intrinsic or mitochondrial)29连接分子（连接分子（ adaptoradaptor）：）：具有一些特殊的功能结构域，如具有一些特殊的功能结构域，如 DDDD、DEDDED、CARDCARD等，等，同种结构域间具有相互结合的倾向同种结构域间具有相互结合的倾向30TheTNFandTNFRsuperfamiliesAggarwalBB。NatRevImmunol.2003，3(9):745-5631CRD：Cys-richrepeat
14、sextracellularDD：deathdomaincytoplasmicessential3233StructureofDeathReceptors胞外区结构相似，有多个富含半胱氨酸保守序列；胞内区均有特殊死亡功能区（约90个氨基酸残基组成的基序, death domain, DD）；死亡功能区无任何酶活性，但可与具有相似死亡结构域的蛋白结合。34Mechanisms of TRAIL Functioning Twofunctionaldeathreceptors(DR4/DR5)Threedecoyreceptors(DcR1,DcR2&OPG)Homotrimer；Capasecas
15、cade35APPbindsDR6totriggeraxondegenerationandneurondeathviadistinctcaspasesNikolaevA,etal.Nature.2009;457(7232):981-9.36Caspase1ICECaspase2ICH-1/Nedd-2Caspase3CPP32/YamaCaspase4TXICH-2ICErelIICaspase5ICErelIIITyCaspase6Mch-2Caspase7Mch-3Caspase8MACHFLICEMch-5Caspase9ICE/LAP6Mch-6Caspase10Mch-4FLICE-
16、2Caspase11ICH3Caspase12ERapoptosis-specificCaspase13ERICECaspase14MICECaspase15Caspase16Caspase17Caspase18Caspases:cysteineasparticacidspecificprotease“C”=cysteine,“asp”=cleaveafterAsp;familyofproteaseswithsimilaraminoacidsequence,structure,substratespecificity37根据根据Caspase Caspase 家族成员之间大小亚单位的同源性家族
17、成员之间大小亚单位的同源性, , 可将他们分为可将他们分为3 3 组组: : 炎症组（炎症组（inflammatory mediatorsinflammatory mediators）:Caspase1,4,5,12,13,14 :Caspase1,4,5,12,13,14 凋亡起始组（凋亡起始组（apoptotic initiatorsapoptotic initiators）：）：Caspase2,8,9,10 Caspase2,8,9,10 凋亡效应组（凋亡效应组（apoptotic executionersapoptotic executioners）：）：Caspase3,6,7Ca
18、spase3,6,7DED:deatheffectordomainCARD:caspaserecruitmentdomain 38StructureandFunctionofCaspasesDED:deatheffectordomainsCARD:caspaserecruitmentdomains39 Caspases are produced as zymogensLavrikIN,JClinInvest.2005;115:2665-7240Schemeofprocaspase-8processingattheCD95DISCLavrikIN,JClinInvest.2005;115:266
19、5-7241MechanismsofCaspaseActivation自自活活化化(autoactivation)(autoactivation)是是指指部部分分Caspase Caspase 酶酶原原具具有有在在高高浓浓度度或或局局部部高高浓浓度度时时形形成成寡寡聚聚复复合合体体可可自自身身激激活活自自身身的的特特性性。主要为凋亡起始组成员主要为凋亡起始组成员, ,。转转活活化化（transactivationtransactivation）是是已已激激活活的的起起始始Caspase Caspase 激激活活其其它它Caspase Caspase 酶原的方式。酶原的方式。非非 Caspase
20、 Caspase 蛋蛋 白白 酶酶 活活 化化 是是Caspase Caspase 酶酶原原激激活活的的另另一一方方式式。例如例如Granzyme BGranzyme B。42Activation model of caspases43HowcaspaseskillICAD&CAD(theinhibitorofCaspase-activatedDNase)Lamins,causinglaminatocollapseandcontributingtochromatincondensation.Cytoskeletons,celljunctionsDeregulationofproteinacti
21、vity444546RegulationofCaspases GeneexpressionPhosphorylation,nitrosylationa.Inactivationofhumancaspase-9byAkt;b.DirectinhibitionofcaspaseactivitythroughactivesitenitrosylationBcl-2proteinfamily:pro-vs.anti-;Caspaseinhibitors:a.痘苗病毒痘苗病毒CrmAandp35;b.FLIPs;c.IAPs47DualFunctionsofCaspase-8Expressionandp
22、hosphorylationstateofcaspase-8intumors:prognosticmarkerortopharmacologicallystimulatecaspase-8processingfortumortherapyFrischSMCancerRes2008;68:4491-348SignalTransductionbydeathreceptorsAshkenaziA.NatRevCancer.2002;2(6):420-3049ImmunolCellBiol(2006)84,879850IntrinsicSignalingPathwayActivationrequire
23、s:-Cytochromecrelease-ATP/dATP-Apaf-1-Cytc/Apaf-1/procaspase-9/ATP(dATP)apoptosome-Caspase-9activationExtrinsicSignalingPathwayActivationrequires: - deathreceptor-adaptorproteins(FADD/TRADD)-DISC(death-inducingsignalingcomplex)-Caspase-8/10activation51Centralroleofmitochondriainapoptosis-线粒体跨膜通道线粒体跨
24、膜通道 (permeability transition (permeability transition pore , PTpore , PT孔孔) ) 的开放的开放-线粒体跨膜电位下降，线粒体跨膜电位下降，Cyt c Cyt c 释放释放- Cyt c/Apaf-1/procaspase- Cyt c/Apaf-1/procaspase- 9/dATP apoptosome 9/dATP apoptosome- Caspase Caspase级联级联- Smac Smac释放释放52StructureofApaf-1Apaf-1:apoptoticproteaseactivatingfac
25、tor-1 5354Inflammasome in inflammation5556Finkel,Science.2001;292(5517):624-626. 线粒体线粒体PT孔主要由位于内膜的腺苷孔主要由位于内膜的腺苷转位因子转位因子ANT和位于外膜的电压依赖和位于外膜的电压依赖性阴离子通道性阴离子通道VDAC等蛋白所组成，等蛋白所组成，PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和降和cytc、凋亡因子、凋亡因子AIF等释放。等释放。Bcl-2家族蛋白对于家族蛋白对于PT孔的开放和关孔的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过
26、与等可以通过与ANT或或VDAC的结的结合介导合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋孔的开放，而抗凋亡类蛋白如白如Bcl-2、Bcl-xL等则可通过与等则可通过与Bax竞争性地与竞争性地与ANT结合，或者直接结合，或者直接阻止阻止Bax与与ANT、VDAC的结合来发的结合来发挥其抗凋亡效应。挥其抗凋亡效应。57Synergismbetweenextrinsicandintrinsicdeathpathwaysbycaspase-processedBid4Cross-talkandintegrationbetweendeath-receptorandmitochondrialpathways4Unde
27、rsomeconditionscross-talkisminimalthetwopathwaysoperateindependently4CaspaseprocessingofBidinducestranslocationofprocessedBidtomito,whereitpromotescytochromecreleaseHengartner,Nature407:770,20005859StefanJ.RiedlNatureReviewsMolecularCellBiology5,897-907PathwaystocelldeathinC.elegans,Fruitfliesandmam
28、mals60(1)Bcl-2基因家族基因家族(2)IAP家族家族(3)FLIP家族家族(4)其他：其他：HSP、NF-kB(5)P53第五节第五节细胞凋亡的基因表达调控细胞凋亡的基因表达调控6162Apoptosis Regulators in Bcl-2 Family63Bcl-2亚家族：抑制细胞凋亡的发生，结构上拥有保守的亚家族：抑制细胞凋亡的发生，结构上拥有保守的BH1BH4的结构域和跨膜区的结构域和跨膜区,BH1与与BH2结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域，同时在同源或异源性二聚体和离子通道结构域是抗凋亡蛋白必备的结构域，同时在同源或异源性二聚体和离子通道的形成中发挥重要的作用，主要包括的
29、形成中发挥重要的作用，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W和和Mcl-1等；等；Bax亚家族：促进细胞凋亡，结构上缺乏亚家族：促进细胞凋亡，结构上缺乏BH4结构域，只含结构域，只含BH1BH3和跨膜区，包括和跨膜区，包括Bax、Bak、Bok；BH3亚家族：促进细胞凋亡，结构上仅具有亚家族：促进细胞凋亡，结构上仅具有1个保守的个保守的BH3同源结构域，主要包括同源结构域，主要包括Bad、Bim、Bid和和Bik等。等。StructureandFunctionofBcl-2FamilyProteinsValentijnAJ,BiochemSocTrans.2004;32(Pt3):421
30、-564Bcl-2family-mediatedapoptosisBcl-2family-mediatedapoptosisAntiapoptotic members: BCL-2, BCL-XL, A1, MCL-1, etc.Proapoptotics: BID, BAD, BIM, BIK, BMF, NOXA, PUMA, etc.65ModelsforinteractionbetweenBH3-onlyproteins,BAX/BAK-likeproteinsandpro-survivalBCL-2-familymembersinsignallinginapoptosis.Stras
31、serA.NatRevImmunol.2005;5(3):189-200.66Smallmoleculesconvertanti-deathfactorsintopro-deathfactorsnaturechemicalbiology200812(4):7226768Inhibitorsofapoptosisproteins(IAPs)IAP(XIAP,c-IAP-1,c-IAP-2,Survivin,Livin):tobindwithpro-caspaseandinhibittheactivationofcaspases;IAPinhibitors：Smac/DIABLO(secondmi
32、tochondria-derivedactivatorofcaspase/directIAP-bindingproteinwithlowpH),tobindwithIAPsandactivatecaspase-9Omi/HtrA269StructureofBIRdomain-containingIAPsRiedlSJ,NatRevMolCellBiol.2004;5(11):897-907. BIRBIR一般由一般由8080个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成, ,全全称为杆状病毒称为杆状病毒IAPIAP重复序列重复序列( ( baculoviral IAP repeat),baculoviral
33、 IAP repeat),为为IAP IAP 抑抑制细胞凋亡所必需的，也是所有制细胞凋亡所必需的，也是所有IAPIAP家家族蛋白共有的结构域。事实上含族蛋白共有的结构域。事实上含BIRBIR结结构域的蛋白质在许多真核生物中都可构域的蛋白质在许多真核生物中都可以见到，但并不是所有含以见到，但并不是所有含BIRBIR结构域的结构域的蛋白都能够抑制凋亡。蛋白都能够抑制凋亡。 RINGRING结构是存在于部分结构是存在于部分IAPIAP蛋白羧基蛋白羧基末端的锌指样结构单元。这种锌指样末端的锌指样结构单元。这种锌指样结构具泛素酶活性结构具泛素酶活性, ,能够促进能够促进caspasecaspase的降解
34、的降解, ,参与凋亡抑制作用。参与凋亡抑制作用。 少数少数IAPIAP分子存在分子存在CARDCARD结构结构, ,是位于是位于IAPIAP分子分子BIRBIR结构和锌指结构之间的一结构和锌指结构之间的一段序列段序列, ,目前尚未证明目前尚未证明CARDCARD结构与抑制结构与抑制凋亡有关。凋亡有关。70MolecularmechanismofIAP-mediatedinhibitionofeffectorcaspases.ReialSJetal.,NatRevMolCellBiol.2004Nov;5(11):897-907.71theMultiplemechanismsofIAPsJese
35、nbergerV,NatRevMolCellBiol.2002;3(2):112-21 72KrammerPH,NatRevImmunol.2007;7(7):532-42.StructureofcFLIP(FLICEinhibitorprotein)familyDEDdomain73Regulation of NF-kB activation by cFLIP74MathewR,ClinCancerRes.2006;12(12):3648-51.75RegulationofNF-kBoncellsurvivalandapoptosis76热激蛋白热激蛋白(heat shock protein
36、(heat shock protein，HSP)HSP) 除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激除参与细胞内一些重要蛋白质分子的构象、稳定性及激酶活性调节之外，酶活性调节之外，HSPHSP另一重要生理功能是对应激状态下另一重要生理功能是对应激状态下的细胞提供保护。近年来的研究证实的细胞提供保护。近年来的研究证实HSPHSP蛋白家族的重要蛋白家族的重要成员如成员如HSP90HSP90、HSP70HSP70及及HSP27HSP27等可以直接作用于细胞的抗等可以直接作用于细胞的抗凋亡机制凋亡机制77JClinInvest.2005;115(10):26332639.HSPandapopto
37、sis78P53&apoptosisp53p53主要功能是监视细胞基因组主要功能是监视细胞基因组DNADNA的完整性。的完整性。 如有损伤，如有损伤，p53p53可以感知这些损伤，可以促使细胞停留在可以感知这些损伤，可以促使细胞停留在G1 G1 期，进行期，进行DNADNA损伤修复，避免错误损伤修复，避免错误DNADNA的进一步复制。同时，的进一步复制。同时， p53p53可以促进可以促进DNADNA修复蛋白的转录合成，从而促进细胞对修复蛋白的转录合成，从而促进细胞对DNADNA损损 伤进行修复，确保遗传物质的稳定性。伤进行修复，确保遗传物质的稳定性。 一旦这种修复无法完成，一旦这种修复无法完
38、成，p53p53将促进一系列凋亡相关蛋白的表将促进一系列凋亡相关蛋白的表 达，例如达，例如BaxBax、PUMAPUMA、NoxaNoxa、Fas,Fas,从而有效的诱导细胞凋亡，从而有效的诱导细胞凋亡， 清除受损的细胞，防止细胞癌化清除受损的细胞，防止细胞癌化79A model for p53 regulation8081associationofTP53mutationsandclinicaloutcomeinselectedcancertypes82Selectedoncogenicpropertiesofmutantp53andtheirunderlyingmechanisms83In
39、terplayofthenuclearandcytoplasmicfunctionsofp53inapoptosis848586p53andmetabolism.KarenH.Vousden&KevinM.RyanWhenmutantsgainnewpowers:newsfromthemutantp53field.RanBrosh&VardaRotterTumoursuppressionbyp53:arolefortheDNAdamageresponse?DavidW.MeekTheexpandinguniverseofp53targets.DanielMenendez,AlbertoInga
40、&MichaelA.Resnickp53andE2f:partnersinlifeanddeath.ShirleyPolager&DoronGinsbergThefirst30yearsofp53:growingevermorecomplex.ArnoldJ.Levine&MosheOrenp53ancestry:gazingthroughanevolutionary.lensWan-JinLu,JamesF.Amatruda&JohnM.Abrams87HeikoHermeking,CancerCell,2007,414-8p53EnterstheMicroRNAWorld88SuzukiH
41、I,etal.Nature.2009Jul23;460(7254):529-33.ModulationofmicroRNAprocessingbyp53P53WTp53-/-aftertreatmentfor8or24hwith0.2gml-1doxorubicin89RegulationofmiRNAbiosynthesisbyp53HeikoHermeking,NatureReviewsCancer2012,12,613-62690Regulationofp53pathwaybymiRNAnetwork91Apoptoticsignallingpathwaysandtheinvolveme
42、ntofmiRNAregulation92939495细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测96针对凋亡不同阶段特征的检测方法针对凋亡不同阶段特征的检测方法 1 早期检测早期检测早期检测早期检测 PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 细胞内氧化还原状态改变的检测 细胞色素C的定位检测 线粒体膜电位变化的检测2 晚期检测晚期检测晚期检测晚期检测 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP nick-end-labeling） LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) Telemerase Detection (端粒酶检
43、测) 3mRNAmRNA水平的检测水平的检测水平的检测水平的检测 97针对不同位置的凋亡特征的检测方针对不同位置的凋亡特征的检测方法法 细胞凋亡的形态学形态学形态学形态学检测方法凋亡细胞的光学显微镜和倒置显微镜观察凋亡细胞的荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察凋亡细胞的电子显微镜观察 细胞膜细胞膜细胞膜细胞膜相关凋亡检测 线粒体线粒体线粒体线粒体相关凋亡检测 胞浆蛋白胞浆蛋白胞浆蛋白胞浆蛋白相关凋亡检测Caspase(半胱天冬氨酸酶)活性检测凋亡相关的非Caspase蛋白酶检测胞浆其他蛋白活性检测 细胞核细胞核细胞核细胞核相关凋亡检测其他98细胞凋亡的检测方法简述细胞凋亡的检测方法简述 一、细
44、胞凋亡的形态学检测一、细胞凋亡的形态学检测 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin VAnnexin V法）法） 三、三、 DNADNA片断化检测片断化检测 四、四、 TUNELTUNEL法法 五、五、 Caspase-3Caspase-3活性的检测活性的检测 六、六、 WBWB检测检测 99Morphology of Apoptotic Cell凋亡诱导剂诱导人肺癌细胞株凋亡诱导剂诱导人肺癌细胞株A549A549发生凋亡，发生凋亡，hoechst 33258hoechst 33258染色染色100DNAfragmentationandtheappearanceof
45、“DNAladder”1011022103104ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI105AnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescenceTimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemedium106107108109110111第六节第六节 凋亡与自噬凋亡与自噬112VariousModelsofCellDeath113Classificationofcelldeathaccordingtothenuclearmorphologyofthe
46、dyingcellNatureImmunology4,416-423(2003)114Classification of cell death according to caspase activationNecrosisCDCD: Apoptosis, Mitotic Catastrophe, Model of Apoptosis-like, Anoikis CICD: Autophagy, Paraptosis, Oncosis, Model of Necrosis-like115Apoptosis and Autophagy自噬（自噬（autophagyautophagy）：就其本义而言
47、就是自己吃自己，指细胞在营）：就其本义而言就是自己吃自己，指细胞在营养缺乏时靠消化自身细胞器而获得能量以度过饥荒的行为。然而，养缺乏时靠消化自身细胞器而获得能量以度过饥荒的行为。然而，在后来的研究中发现自噬并不只是细胞的一个生存策略，同时也在后来的研究中发现自噬并不只是细胞的一个生存策略，同时也是细胞死亡的一种方式。如在是细胞死亡的一种方式。如在ParkinsonParkinsons s 和和AlzheimerAlzheimers s 疾疾病病变的细胞中，经常可以看到细胞自噬的现象。病病变的细胞中，经常可以看到细胞自噬的现象。自噬则是利用溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行自噬则是利用
48、溶酶体对细胞自身体内的部分细胞质和细胞器进行一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡。自一系列降解的过程。它的显著特征是形成大量自体吞噬小泡。自噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显噬过程中的细胞骨架虽然解聚，但并不像凋亡过程那样发生明显的细胞骨架降解。的细胞骨架降解。“self-killing”“self-eating”116JClinInvest.2005Oct;115(10):2679-88.117 自噬现象最早在哺乳动物中的研究是由Ashford和Porten于1962年通过电子显微镜在人的肝细胞中观察到，但直到1997年日本科学家Yoshinori Oh
49、sumi小组在酵母菌中发现自噬相关基因（autophagy related gene, Atg），对自噬的研究才有新的进展。118诱导细胞发生自噬的因素：诱导细胞发生自噬的因素：饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNADNA损伤、放疗、化疗等等损伤、放疗、化疗等等119自噬的特性：自噬的特性：1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下）自噬是细胞消化掉自身的一部分，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。很少发生自噬，除非
50、有诱发因素的存在。细胞外的：如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等细胞外的：如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等细胞内的：代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等细胞内的：代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等由于这些因素的经常性存在，因此细胞保持了一种很低的基础的自噬活性以维持自稳。由于这些因素的经常性存在，因此细胞保持了一种很低的基础的自噬活性以维持自稳。2）自噬过程很快，被诱导后）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体形成，即可观察到自噬体形成，2h后自噬溶酶体基本降解消后自噬溶酶体基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。失。这
51、有利于细胞快速适应恶劣环境。3）自噬的可诱导特性：表现在）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别5）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间，自噬都普遍被保留下来。间，自噬都普遍被保留下来。120121Autophagy
52、pathway and its role in cellular adaptation to nutrient deprivationLevineB,Nature.2007;446(7137):745-7.122RegulationoftheAutophagicPathway123AutophagyinHealthandDisease124自噬和肿瘤自噬和肿瘤双刃剑双刃剑与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。噬是被优先保留的。自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多，相反自噬基因自噬基因敲除的动物自发肿瘤增多，相反自噬基因敲除后，增加了
53、化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。敲除后，增加了化疗、放疗、免疫治疗的敏感性。125自噬与肿瘤自噬与肿瘤1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。2）当
54、化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。赢得时间和条件。3）由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细）由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免
55、疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会瘤在代谢应激时会“组成性组成性”活化活化PI3K信号以抑制自噬。信号以抑制自噬。126对不同的细胞，自噬的作用可能不同。对不同的细胞，自噬的作用可能不同。相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，
56、癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括Beclin1在内的众多抑癌基在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。因失活，自噬活力降低。对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。进肿瘤的生长。自噬与肿瘤的双重关系自噬与肿瘤的双重关系127Conflic
57、ting effects of autophagy on cancerLevineB,Nature.2007;446(7137):745-7.128Immune-related autophagy functions in different cell typesKuballa P, et al., Annu Rev Immunol. 2012;30:611-46. 129Beclin 1interacting proteins modulate autophagy during microbial infectionKuballa P, et al., Annu Rev Immunol. 2
58、012;30:611-46. 130CrosstalkbetweenAutophagyandApoptosisAutophagyconstitutesastressadaptationthatavoidscelldeathandsuppressesapoptosisundercertaincircumstances;Autophagyconstitutesanalternativecell-deathpathwayinothercellularsettings;Autophagyandapoptosismaybetriggeredbycommonupstreamsignals,andsomet
59、imesthisresultsincombinedautophagyandapoptosis.131BaehreckeEH.NatRevMolCellBiol.2005;6(6):505-10.Celldeathcaninvolvebothcaspasesandautophagy132Lee JS, et al.Nat Cell Biol. 2009 Nov;11(11):1355-62FLIP-mediated autophagy regulation in cell death control133自噬样死亡到目前为止还只是一种现象，因为我们自噬样死亡到目前为止还只是一种现象，因为我们只知
60、道细胞自噬样死亡时胞浆中存在大量液泡，且在形只知道细胞自噬样死亡时胞浆中存在大量液泡，且在形态学上与凋亡有一定的区别，而对自噬与死亡的因果关态学上与凋亡有一定的区别，而对自噬与死亡的因果关系尚不清楚，更不知道它对群体有什么好处、与凋亡相系尚不清楚，更不知道它对群体有什么好处、与凋亡相比刺激信号有什么不同。就目前的研究进展来说，自噬比刺激信号有什么不同。就目前的研究进展来说，自噬是肯定的，鉴定和监测方法也较成熟，但自噬样死亡是是肯定的，鉴定和监测方法也较成熟，但自噬样死亡是模糊的，鉴定比较困难，且尚需生理情况下和临床的研模糊的，鉴定比较困难，且尚需生理情况下和临床的研究证据来支持。究证据来支持。
61、134QuestionstoBeAnsweredinAutophagyvHowandwhendoesautophagystartinacell?vRegulationofAutophagyvAutophagyanddiseasevAutophagy-basedtherapeutics（具有自噬抑制作用可作为化疗增强剂使用的两个典型药物是氯喹和羟氯喹）（具有自噬抑制作用可作为化疗增强剂使用的两个典型药物是氯喹和羟氯喹）135136137细胞凋亡与坏死之细胞凋亡与坏死之间相互转换的分子间相互转换的分子“开关开关”138RIP1andRIP3driveprogrammednecrosis(necroptosis)viamitochondrialdysfunction.139重点问题l细胞凋亡和程序化细胞死亡的概念细胞凋亡和程序化细胞死亡的概念l细胞凋亡的特点及其与细胞坏死的区别细胞凋亡的特点及其与细胞坏死的区别l细胞凋亡内源性途径与外源性途径的主要参与分子细胞凋亡内源性途径与外源性途径的主要参与分子lCapsase家族成员的分类及结构特点、功能家族成员的分类及结构特点、功能lBcl-2家族成员的分类及结构特点、功能家族成员的分类及结构特点、功能l细胞自噬的概念细胞自噬的概念140个人观点供参考，欢迎讨论
