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1、1光谱分析光谱分析原子光谱原子光谱原子吸收原子吸收原子发射原子发射原子原子荧光荧光分子分子光谱光谱分子分子吸收吸收紫外紫外- -可见光谱可见光谱红外光谱红外光谱分子发光分子发光2第二章第二章 分子发光分析分子发光分析分子分子吸收吸收能量能量激发为激发态激发为激发态释放出释放出能量能量基态基态电能电能化学能化学能光能光能称为称为“发光发光”光的形式释放光的形式释放荧光荧光磷光磷光分子发光分子发光光致发光光致发光化学发光化学发光辐射跃迁辐射跃迁非辐射跃迁非辐射跃迁以热的形式释放以热的形式释放 分子荧光分析法分子荧光分析法一、基本原理一、基本原理（一）荧光和磷光的产生（一）荧光和磷光的产生 从分子结
2、构理论来讨论从分子结构理论来讨论3分子中电子分子中电子的能量状态的能量状态电子所处的能级电子所处的能级振动能级振动能级转动能级转动能级电子的多重态电子的多重态J=2S+1S：为各电子自旋量子为各电子自旋量子数的代数和数的代数和S=0, J=1 单重态单重态S表示表示（所有电子都是自旋配对的）（所有电子都是自旋配对的）S=1, J=3三重态三重态 T表示表示大多数基态分子都处于单重态大多数基态分子都处于单重态电子在跃迁过程中伴随着电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化（自旋平行）自旋方向的变化（自旋平行）4基态单重态S 激发态单重态S 激发态三重态T 激发单重态激发单重态S与激发三重态与激发三重态
3、T的不同点：的不同点： S是抗磁分子，是抗磁分子，T是顺磁分子是顺磁分子 tS = 10-8s, tT = 10-41s；(发光速度很慢) 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁， 基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁； 激发三重态的能量较激发单重态的能量低激发三重态的能量较激发单重态的能量低5其中其中S0、S1和和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态T1和和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。V=
4、0、1、2、3、表示基态和激发态的振动能级。表示基态和激发态的振动能级。 2分子内的光物理过程 6S0S1S2T1吸光1吸光2振动弛豫振动弛豫:在同一电子能级在同一电子能级中，电子由高振中，电子由高振动能级转至低振动能级转至低振动能级，而将多动能级，而将多余的能量以余的能量以热热 的的形式发出。形式发出。发生发生振动弛豫的时振动弛豫的时间为间为10-12s数量数量级级。非辐射能量传递过程；非辐射能量传递过程；7S0S1S2T1吸光1吸光2内转移内转移: 当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重重 叠叠时，时， 常发生电子由高能级以常发生电子由高能级以无辐射
5、跃迁方式无辐射跃迁方式转移至低能级。转移至低能级。（S1 转移转移 S2）8S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3系间窜跃系间窜跃: 指指不同多重态间不同多重态间的的无辐射跃迁无辐射跃迁， 例如例如S1T1就是一就是一种系间窜跃。种系间窜跃。 通常，发生系间通常，发生系间窜跃时，电子由窜跃时，电子由S1的较低振动能级转的较低振动能级转移至移至T1的较高振动的较高振动能级处。能级处。9辐射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射荧光发射:电子由电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态基态 S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3荧光荧光得到最大波长为得到最大波长为3 3的荧光的荧光由
6、图可见，发射荧光的能量由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小比分子吸收的能量小 3 3 2 110磷光发射磷光发射: 电子由基态单重态激发至第一电子由基态单重态激发至第一激发三重态的几率很小，因为这激发三重态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最但是，由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间窜跃低振动能级，有可能以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，便发射磷光， 这个跃迁过程（这个跃迁过程（T1S0）也是
7、自也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约旋禁阻的，其发光速率较慢，约为为10-4-10s。因此，这种跃迁所因此，这种跃迁所发射的光，发射的光，在光照停止后，仍可在光照停止后，仍可持续一段时间持续一段时间。S0S1S2T1吸光1吸光2荧光3磷光磷光磷光外转移外转移 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。荧光与磷光的根本区别：荧光与磷光的根本区别：11磷光磷光是由是由激发三重态激发三重态最低振动能层至基态最低振动能层
8、至基态荧光荧光是由激发是由激发单重态单重态最低振动能层至基态最低振动能层至基态区别区别(二二)荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱激发光谱:(ex)以不同波长的入射光激发荧光物质以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧在荧光最强的波长处测量荧光强度光最强的波长处测量荧光强度即以激发光波长为横坐标即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为以荧光强度为纵坐标绘制纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线曲线即可得到激发光谱曲线。发射光谱：发射光谱：(em)固定激发光波长（最大）固定激发光波长（最大）然后测定不同的波长时所发射的荧光强度然后测定不同的波长时所发射的荧光强度即可绘制荧光发射光谱曲线即
9、可绘制荧光发射光谱曲线12在荧光的产生过程中，由于存在各种形在荧光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移动，以磷光最大发射波长都向长波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。弱。131415激发光谱与发射光谱的关系a. Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b. 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与
10、激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2 , 1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最低最低振动能级振动能级再跃迁回到再跃迁回到基态基态，产生波长一定的荧光，产生波长一定的荧光c. 镜像规则镜像规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。 （三）（三）荧光的影响因素分子产生荧光必须具备两个条件：分子产生荧光必须具备两个条件： 分子必须具有与所照射的辐射频分子必须具有与所照射
11、的辐射频率率(紫外紫外-可见光）相适应的结构可见光）相适应的结构（共（共轭双键）轭双键），才能吸收激发光；，才能吸收激发光；吸收了与其本身特征频率相同的吸收了与其本身特征频率相同的能量能量之后，必须具有一定的荧光量之后，必须具有一定的荧光量子产率。子产率。161.荧光效率荧光效率它表示物质它表示物质发射荧光的能力发射荧光的能力，通常用下，通常用下式表示式表示17荧光效率越高；荧光效率越高；物质物质发射荧光发射荧光越强越强kf为荧光发射过程的速率常数（为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关）与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）化学环境
12、）凡使凡使kf 值升高而使值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。值降低的因素，都可增强荧光。2.荧光与有机化合物结构的关系荧光与有机化合物结构的关系（1）跃迁类型）跃迁类型实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生迁，再发生 跃迁而得到荧光。跃迁而得到荧光。（2）共轭效应）共轭效应实验证明，容易实现实验证明，容易实现 激发激发的芳香族化合物的芳香族化合物容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔
13、吸光也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子系数，有利于产生更多的激发态分子18(3) (3) 刚性平面结构刚性平面结构实验发现，多数具有刚性平面结构的实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰减少，也就减少了碰撞去活的可能性。撞去活的可能性。1920（4）取代基效应）取代基效应芳环上芳环上取代基取代基给电子基团，荧光增强给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-N
14、H2）产生了产生了p- 共轭作用，增强了共轭作用，增强了 电子共轭程度，使最低电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。吸电子基团吸电子基团减弱甚至会减弱甚至会猝猝灭荧光灭荧光如如-COOH、-NO、-C O、卤素卤素卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低在重原子中，能级之间的交叉现象比在重原子中，能级之间的交叉现象比 较严重，因此容易发生较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的速率3.金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光大多数无机盐类
15、金属离子，在溶液中只能大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。因而不发生荧光。但是，但是，若这些化合物和金属离子形成螯若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的合物，随着分子的刚性增强刚性增强，平面结构的，平面结构的增大，常会发生荧光增大，常会发生荧光212223 同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度同一种荧光物质溶于不同溶剂，其荧光光谱的位置和强度可能有明显不
16、同。可能有明显不同。 4 4溶剂效应溶剂效应 一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的一般情况下，随着溶剂的极性的增加，荧光物质的* 跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移。 5 5 温度的影响温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，一般说来，大多数荧光物质的溶液随着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增加荧光效率和荧光强度将增加如荧光素的乙醇溶液在如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低以下每降低10 ，荧光效率增加荧光效率增加3%，冷至，冷至-80时，荧光效率为时，荧光效率为100%。（四）溶液的荧光（或磷光）强度（四）
17、溶液的荧光（或磷光）强度1.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度荧光强度If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia与荧光量与荧光量子产率子产率 。If = Ia式中式中 为荧光量子效率，又根据为荧光量子效率，又根据Beer定律定律A=-lgI/I0I=I0.10-AIa=I0-I=I0(1-10-A)I0和和I分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得If= I0(1-10-kbc)24整理得：整理得：If=2.3 I0kbc当入射光强度当入射光强度I0和和b一定时，上式为：一定时，上式为：If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比，
18、即荧光强度与荧光物质的浓度成之正比， 但这种线性关系只有在极稀的溶液中，但这种线性关系只有在极稀的溶液中， 当当 kbkbc 0.050.05时才成立。时才成立。 对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。和浓度不呈线性关系。25262 、影响荧光强度的环境因素、影响荧光强度的环境因素因素因素溶剂溶剂一般溶剂效应一般溶剂效应折射率和介电常数的影响折射率和介电常数的影响特殊溶剂效应特殊溶剂效应荧光体和溶剂分子间的荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用特殊化学作用如氢键的生成如氢键的生成同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光
19、谱不同同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱不同温度温度温度上升使荧光强度下降温度上升使荧光强度下降内部能量转化作用增大内部能量转化作用增大碰撞频率增加碰撞频率增加，使外转换的几率增加，使外转换的几率增加酸度酸度化合物所处状态不同化合物所处状态不同电子构型上有所不同电子构型上有所不同荧光强度和荧光光谱不同荧光强度和荧光光谱不同27283、荧光猝灭、荧光猝灭定义：定义：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用引起荧光强度降低的现象的相互作用引起荧光强度降低的现象类型类型碰撞猝灭碰撞猝灭激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞激发单重态的荧光分子与猝灭剂分
20、子相碰撞荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态静态猝灭静态猝灭荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的络合物的络合物转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭发生电子转移反应的猝灭发生电子转移反应的猝灭猝灭剂与荧光物质猝灭剂与荧光物质荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未浓度较高单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭溶解氧溶解氧与与荧光物质荧光物质29光源光源氙灯和高压汞灯氙灯和高压汞灯激发单色器激发单色器光栅光栅扫描激发光谱，选择激发波长扫
21、描激发光谱，选择激发波长样品池样品池I0 IIf发射单色器发射单色器扫描发扫描发射射光谱光谱消除其它光线的干扰消除其它光线的干扰获得所需的荧光获得所需的荧光检测器检测器显示器显示器与分光光度计的差别与分光光度计的差别两个单色器两个单色器两个单色器互成直角两个单色器互成直角光电倍增管光电倍增管二、荧光分析仪二、荧光分析仪30三、分子荧光分析法及其应用三、分子荧光分析法及其应用1. 荧光分析方法的特点荧光分析方法的特点（1）灵敏度高）灵敏度高 （2）选择性强）选择性强（3）试样量少和方法简单）试样量少和方法简单 （4）提供比较多的物理参数）提供比较多的物理参数2、荧光、荧光定量定量分析的分析的方法
22、方法方法方法标准曲线法标准曲线法荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系荧光强度与荧光物质浓度成正比的关系比较法比较法同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液同样条件下，测定试样溶液和一标准溶液的荧光强度，直接通过比例计算的荧光强度，直接通过比例计算313 3、荧光分析法的应用、荧光分析法的应用方法方法直接荧光法直接荧光法被测物本身有荧光被测物本身有荧光被测物与试剂反应后被测物与试剂反应后F F与物质的与物质的浓度成正比浓度成正比荧光猝灭法荧光猝灭法被测物使荧光熄灭被测物使荧光熄灭由荧光强度降低的强度来测定被由荧光强度降低的强度来测定被测物的含量测物的含量 间接荧光法间接荧光法某些阴离子夺取金属络合物中
23、金属某些阴离子夺取金属络合物中金属离子，而释放出能发荧光的配位体离子，而释放出能发荧光的配位体催化荧光法催化荧光法反应速度慢，荧光微弱，难测定反应速度慢，荧光微弱，难测定金属离子将加速反应进行金属离子将加速反应进行32磷光分析法磷光分析法 1如何获得较强的磷光增加试样的刚性增加试样的刚性: 低温冷冻低温冷冻 固体磷光法：固体磷光法：吸附于固相载体（滤纸）吸附于固相载体（滤纸） 分子缔合物的形成：分子缔合物的形成：加入表面活性剂等加入表面活性剂等 重原子效应：重原子效应：加入含重原子的物质，如银盐等加入含重原子的物质，如银盐等 敏化磷光：敏化磷光：通过能量转移产生磷光通过能量转移产生磷光磷光发射
24、：电子由第一激发三重态的最低振动能级磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级 基态，基态， T1 S0跃迁；跃迁； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）33 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光在有荧光发射的同时测量磷光磷光分析仪器 应用34化学发光分析法化学发光分析法一、基本原理一、基本原理A +B C + D* D* D + h 某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光发射出一定波长的
25、光（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物（2）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区位于可见光区（3）发光持续时间较长，反应持续进行）发光持续时间较长，反应持续进行发光反应如果存在于生物体发光反应如果存在于生物体(萤火虫萤火虫)中，称生物发光中，称生物发光35化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：化学反应所决定化学反应所决定 化学反应和环境因素化学反应和环境因素化学发光强度化学发光强度( (单位时间发射的光量子
26、数单位时间发射的光量子数) )：dc/dt是分析物参加反应的速率是分析物参加反应的速率 36若若化学化学发光光反应是反应是一级动力学反应则一级动力学反应则即发光总强度即发光总强度与被测物浓度成线性：与被测物浓度成线性：二、化学发光反应类型二、化学发光反应类型1. 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光直接发光直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子 A + B C* + D C* C + h37间接发光间接发光是被测物A或B，通过化学反应生
27、成初始激发态产物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h2. 气相化学发光和液相化学发光气相化学发光和液相化学发光（1）气相化学发光）气相化学发光化学发光反应在气相中进行化学发光反应在气相中进行 主要有主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等等 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 38（2）液相化学发光）液相化学发光 化学发光反应在液相中进行化学发光反应在液相中进行应用最多的发光试剂：鲁米
28、诺（应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；氨基苯二甲酰肼）； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺鲁米诺- H2O2发光反应反应速度慢，可检测低至发光反应反应速度慢，可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；39生物发光生物发光是化学发光中的一类，特指在生物体内通过化学反应产生的发光现象，主要由酶来催化产生的。多种细菌、昆虫、鱼类等均能发光40荧荧光光灯灯：当当高高压压加加在在灯灯管管两两端端后后，灯灯管管内内少少数数电电子子高高速速撞撞击击电电极极后后产产生生二二次次电电子子发发射射，开开始始放放电电，管管内内的的水水银银受受电
29、电子子撞撞击击后后，激激发发辐辐射射出出253.7nm的的紫紫外外光光，产产生生的的紫紫外外光光激激发发涂涂在在管管内内壁壁上上的的荧荧光光粉粉而而产产生生可可见见光光。 （可可见见光光的的颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同）颜色将依据所选用的荧光粉的不同而不同） 41荧荧光光棒棒中中的的化化学学物物质质主主要要由由三三种种物物质质组组成成：过过氧氧化化物物、酯酯类类化化合合物物和和荧荧光光染染料料。简简单单地地说说，荧荧光光棒棒发发光光的的原原理理就就是是过过氧氧化化物物和和酯酯类类化化合合物物发发生生反反应应，将将反反应应后后的的能能量量传传递递给给荧荧光光染染料料，再再由由染染料料发发
30、出出荧荧光光。目目前前市市场场上上常常见见的的荧荧光光棒棒中中通通常常放放置置了了一一个个玻玻璃璃管管夹夹层层，夹夹层层内内外外隔隔离离了了过过氧氧化化物物和和酯酯类类化化合合物物，经经过过揉揉搓搓，两两种种化化合合物物反反应应使得荧光染料发光。使得荧光染料发光。 42三、化学发光的测量仪器三、化学发光的测量仪器仪器主要包括：仪器主要包括： 样品室、光检测器、放大器和信号输出装置等部件样品室、光检测器、放大器和信号输出装置等部件43荧光法测定维生素荧光法测定维生素B2片剂中核黄素含量片剂中核黄素含量 一、实验目的：一、实验目的：1 1学习和掌握荧光光度分析方法学习和掌握荧光光度分析方法2 2了
31、解荧光分光光度计的结构及使用方法了解荧光分光光度计的结构及使用方法二、实验原理：二、实验原理：维生素维生素B2结构式结构式 维生素维生素B2，又叫核黄素，又叫核黄素，橘黄色橘黄色,无臭的针状晶体无臭的针状晶体 易溶于水而不溶于易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂乙醚等有机溶剂 在中性或酸性溶液中稳定在中性或酸性溶液中稳定光照易分解，对热稳定光照易分解，对热稳定44维生素维生素B2水溶液在水溶液在430-440nm蓝光或紫外光照射下蓝光或紫外光照射下 会发生绿色荧光，荧光峰在会发生绿色荧光，荧光峰在535nm,在在pH=6-7溶液溶液中荧光强度最大，在中荧光强度最大，在pH=11的碱溶液中荧光消失，的
32、碱溶液中荧光消失，所以可以用荧光光谱法测定维生素所以可以用荧光光谱法测定维生素2的含量的含量 三、实验用品：三、实验用品： 1 1仪器：仪器： 荧光分光光度计，移液管，容量瓶，棕色试剂瓶，荧光分光光度计，移液管，容量瓶，棕色试剂瓶， 比色管，烧杯，离心机，离心管比色管，烧杯，离心机，离心管 2 2药品：药品： 核黄素（生化试剂），冰醋酸（核黄素（生化试剂），冰醋酸（ARAR）, ,盐酸（盐酸（ARAR） 氢氧化钠，市售维生素氢氧化钠，市售维生素B2B2片剂片剂45四、实验步骤：四、实验步骤：1 1、试剂溶液的配制、试剂溶液的配制 1 1）5 5醋酸溶液醋酸溶液 取取5 5份冰醋酸与份冰醋酸与9
33、595份体积蒸馏水混合份体积蒸馏水混合 2 2）10.010.0mgmgL L-1-1VBVB2 2标准溶液：标准溶液：准确称取准确称取10.010.0mgVBmgVB2 2 将其溶解于少量的将其溶解于少量的5%5%HAcHAc中，转移至中，转移至1 1L L容量瓶中用容量瓶中用5%5%HAcHAc 稀释至刻度，该溶液应装于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存稀释至刻度，该溶液应装于棕色试剂瓶中，置阴凉处保存 3 3）待测液：）待测液：取市售取市售VBVB2 2一片，置于一片，置于5050mLmL烧杯中，加入约烧杯中，加入约 12 12mL 5%HAcmL 5%HAc溶液，用玻璃棒捣碎药片，水浴加热使样
34、品溶液，用玻璃棒捣碎药片，水浴加热使样品 由混浊变为基本透明后取下冷却，转移并加入由混浊变为基本透明后取下冷却，转移并加入5%5%HAcHAc溶液溶液 定容至定容至100 100 mLmL。取数毫升于离心管中进行离心，用移液取数毫升于离心管中进行离心，用移液 管准确移取管准确移取5 5 mLmL的上层清液并定容成的上层清液并定容成5050mLmL，贮于棕色试贮于棕色试 剂瓶中，置阴凉处保存剂瓶中，置阴凉处保存 2 2、激发光和荧光波长的选择、激发光和荧光波长的选择 准准确确移移取取10.010.0mgmgL L-1-1VBVB2 2标标准准溶溶液液5.0 5.0 mLmL于于5050mLmL容
35、容量量瓶瓶中中定定容容。转转移移部部分分溶溶液液至至石石英英比比色色皿皿中中，将将荧荧光光分分光光光光度度计计的的荧荧光光波波长长暂暂定定在在525 525 nmnm处处，在在200200500 500 nmnm波波长长范范围围内内对对激激发发波波长长进进行行扫扫描描，记记录录激激发发光光谱谱曲曲线线，约约在在265265、372372、442442nmnm有有三三个个峰峰。然然后后将将激激发发波波长长设设定定在在442442nmnm处处，在在400400700700nmnm波波长长范范围围内内对对荧荧光光波波长长扫扫描描，记记录录荧荧光光光光谱谱曲曲线线，约约在在525525nmnm处处荧荧
36、光光强强度度最最大大。从从激激发发和和发发射射光光谱谱上上确确定定最最佳佳的的激激发发和和发发射波长射波长463 3、标准系列溶液的配制、标准系列溶液的配制在在五五个个干干净净的的5050mLmL容容量量瓶瓶中中，分分别别加加入入1.00 1.00 mLmL，2.00 2.00 mLmL，3.00 3.00 mLmL，4.00 4.00 mLmL和和5.00 5.00 mLmL定定容容至至5050mLmL。4 4、标准溶液的测定标准溶液的测定设设置置适适当当的的仪仪器器参参数数, , 在在最最佳佳激激发发波波长长和和发发射射波波长长处从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。处从稀到浓测量系列标准溶
37、液的荧光强度。5 5、未知试样的测定、未知试样的测定取取待待测测液液5.0 5.0 mLmL置置于于5050mLmL容容量量瓶瓶中中，用用5%5%HAcHAc溶溶液液稀稀释释至至刻刻度度，摇摇匀匀。用用测测定定标标准准系系列列时时相相同同的的条条件件，测量其荧光强度测量其荧光强度。47五、数据处理：五、数据处理： 0 1 2 3 4 5 6VBVB2 2 标标mLmL 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00VBVB2 2待待mLmL 5.00用用H H2 2O O定容定容(VB(VB2 2) ) 0.00 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 (mgL-1 )荧光强度荧光强度(F)1 1用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2 2根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度VB2 % %=48
