第三章 固定化酶反响动力学•酶的固定化•外分散对固定化酶反响动力学的影响•内分散对固定化酶反响动力学的影响•分散影响下的动力学假象 3.1 酶的固定化•背景•酶的固定化方法•影响固定化酶活力的要素•固定化对酶动力学特征的影响 3.1.1 背景•游离酶参与反响的缺陷：1〕稳定性差、液相中含量少，2〕反响终了后不易回收、3〕酶、底物和产物处于同一相，对产物分别不利•固定化酶：即水不溶性酶，是经过物理的或化学的方法，将溶液酶转变为在一定的空间内其运动遭到完全约束，或遭到部分约束的一种不溶于水但仍具有催化活性的酶，它能以固相形状作用于底物进展催化反响•其优点：可以长期保管在反响器内反复运用，易实现延续化消费；反响终了后易与产物分别，简化了产物分别工艺，其大多数固定化酶稳定性也比游离酶好•缺陷：活力会下降，反响易受传质速率的控制，对大分子底物、产物不适用•研讨历史：1916年，Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被吸 附到骨碳粉末上，并在吸附形状下具有催化活性；以后以色列科学家对酶的固定化方法、固定化的理化性质等进展了开创性的研讨，1969年日本的千叶一郎将固定化氨基酸酰化酶运用于DL－氨基酸的拆分上，1971年国际酶工程会议给出了固定化酶的定义。
3.1.2 酶的固定化方法•载体结合法•交联法•包埋法物理结合法离子结合法共价结合法凝胶包埋微胶囊包埋纤维素包埋 影响固定化酶催化活力的要素•构象效应：由于载体与酶之产的共价键作用，引起酶的活性部位发生扭曲变形，改动了酶活性部位的三维空间构造，减弱了酶与底物的结合力，导致酶的活性下降•位阻效应：由于载体选择不当或载体空隙太小，致使酶的活性部位不易与底物结合，对酶的活性部位呵斥了空间妨碍•分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等，使得底物和产物及其效应物在微环境和宏观环境中浓度不同的景象•分散效应：底物、产物和效应物的迁移和运转速率遭到限制的一种效应 酶的固定化对其动力学特征的影响•缘由：由于酶的活性中心的氨基酸残基的空间构造和电荷形状发生了变化，或者固定化酶的周围构成了能对底物传送产生影响的分散层或静电的相互作用等•对底物专注性的改动•稳定性的改动•最适pH值和温度的改动•米氏常数的改动 3.2 外分散的限制造用•特点•液固相间的传质速率•外分散的限制造用•外分散有效因子 3.2.1 外分散的特点•酶促反响过程与传质过程是各自独立的•底物先从液相主体分散到固定化酶的外外表•发生反响•产物从固定化酶的外外表分散进入液相主体 3.2.2 液固相间的传质速率•由于搅拌，反响体系中的液相主体的底物浓度处处一样，假定为S0，底物在颗粒外表因反响而耗费，同时由于液体的粘性，在固液外表附近产生一个滞流层，而固体外表液体流速率为0，因此在滞流层产生浓度梯度，进而导致物质的传送，且传质阻力全部集中在滞流层。
• 根据Fick第一定律，得液固相间的传质速率为• 其中Ds为底物在液相中的分子分散系数，m2/s• a为固定化酶的比外表积，m-1• S0SiRR+δ 3.2.3 外分散的限制造用•固定化酶外外表的反响速率可表示为• 当化学反响速率和传质速率相差不大时，体系在稳态条件下，有下式成立，传质速率＝化学反响速率，即：• 求解此方程，得出• 无因次化处置，令 解之得： ，当B>0时取+号；当B<0时，取-号，其中 这里，Da准数是对反响控制步骤时行描画的一个重要的无因次数群，其物理意义为 ，因此当Da>>1〔50〕时，此时固定化酶反响的控制步骤为传质，此时 Si=0,RSi=KLaS0，反之，当Da<<1(0.1)，此时固定化酶反响的控制步骤为动力学〔化学反响速率〕，即Si=S0， ，称为最大本征反响速率 3.2.4 外分散有效因子• ， •根据此定义式知： 因此可以根据 判别外分散的影响。
•因此在利用固定化酶进展反响时，总是希望 尽能够接近1，此时应控制反响条件，使Da准数尽能够地小，由 知，可以经过降低固定化酶颗粒的粒径，提高液体的流速及适当添加液相主体的底物浓度来使Da减小 的关系•由图中可以看出：•当底物浓度添加而Da不变时，随着底物浓度的添加， 添加，即添加底物浓度，可以抑制外分散的影响，当底物浓度不变时，Da添加， 减少，且当Da<0.1时， 接近1 可观测丹克莱尔准数〔 〕•令 ，当传质速率和反响速率相差不大时，在稳定形状下有下式成立， ，因此得到 ，从此式中可以看出：• 当 时， ，外分散影响可忽略，• 当 时， ，外分散影响明显。
• 怎样识别外分散的影响？ 3.3 内分散的限制造用•特点•液体在微孔内的分散速率•微孔内反响与分散的关系式•内分散有效因子•表观泰勒模数 3.3.1 内分散的特点•对于多孔的固定化酶颗粒或膜，具有催化作用的部位根本上是在微孔的内外表，因此分散过程和反响过程是同时发生的•在微孔内，由于内分散阻力的存在，反响组分在微孔内的浓度分布是不均匀的，对于底物，其浓度在固定化酶外外表处最高，在颗粒或膜中心处最低，构成了由表及里浓度逐渐降低的分布，由于反响和分散同时进展，所以沿微孔方向，反响速率也在下降，在颗粒中心处，反响速率最低•分散过程与微孔构造亲密相关 3.3.2 液体在微孔内的分散•液体在单一圆柱形微孔内的分子分散速率可用Fick第一定律来表示：• • • 其中Ds为底物在液相中的分子分散系数，普通在1×10－9 m2/s• z为沿分散方向的间隔，m• Ns为底物在单位时间内经过单位截面积微孔的量，moL/(m2s)•但固定化酶颗粒或膜的微孔是非圆柱形的，底物在微孔内的分散系数要比在液相主体中小得多，工程上采用有效分子分散系数来表示。
•分散中发生在微孔内，且微孔面积与颗粒外外表积之比等于孔隙率•微孔的外形是弯曲的，因此引入曲节因子，故在有效分子分散系数可表示为 3.3.3 微孔内分散与反响的关系式•球状固定化酶•片状固定化根本假设模型的建立颗粒内底物浓度与分散阻力的关系 3.3.3.1球状固定化酶之根本假设•固定化酶颗粒是等温的•颗粒内传质为分散，且服从Fick第一定律，Des不随位置而变化•颗粒是均匀的，不仅其活性分布均匀，性质也均匀•底物与产物分配系数为1，固定化酶活性稳定•反响为单底物限制，底物与产物的浓度仅沿半径方向变化 球状固定化酶之模型的建立•假定球状固定化酶的半径为R，在距球中心为r处取一壳层，其厚度为dr，底物经过微孔由外向内分散，且经过此壳层，底物在〔r+dr〕处分散进入，在r处分开，并在壳层内发生酶促反响而耗费底物，以分散方面为正方向，那么单位时间内分散进入微元壳层的底物的量为•单位时间内由分散分开微元壳层的底物的量为：•单位时间内微元壳层内的底物的反响量为•在稳态条件下，沿分散方向，底物的物料衡算式可表示为• 流入量－流出量＝反响量 ，即： rr+dr分散方向 上式可变为 ，重排后得两边同除以r2dr， 得即 上式变为 球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之一•双曲函数 ，首先要进展无因次化处置：令• •对于球形固定化酶， ，那么有• 整理：即： ，利用边境条件求解：该方程无解析解，只需数值解〔数值计算法是研讨数学问题的一类近似解法，即从一组原始数据，按照某种确定的运算规那么，进展有限步运算，最终获得数学问题数值方式的满足某种精度要求的近似解，如龙格库塔法，近似解也可做成图〕 底物浓度沿半径分布图•从右图可以看出，对同一位置r处，随着Φ的添加，底物浓度在减少。
•Ф的大小，表征了内分散阻力的大小，因此随内分散阻力的增大，同一位置处底物浓度减小，而且当Ф不变时，愈往颗粒内部，底物浓度越小•当内分散阻力较小时， Ф＝0.2,1,底物可以到过颗粒中心处，但当内分散阻力较大时， Ф=5,10,底物还未到达颗粒中心处就反响掉了•图 球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之二•当 ，同样对 进展无因次化处置，得 ，同样给定边境条件进展求• 解，得 球状固定化酶之颗粒内底物浓度与阻力的关系之三•当 •对于零级反响动力学，反响速率与底物浓度无关，但要发生反响，必需有底物存在，同样给定边境条件对其进展求解，得•当底物浓度一定时，使固定化酶颗粒中心处底物浓度恰好为0的颗粒半径，称为临界半径， 3.3.3.2 片状固定化酶•假定酶膜的厚度为2L，但厚度与其长度与宽度相比要小得多，因此底物的分散只思索与两个大的侧面相垂直方向上的分散，而忽略其他四个侧面的分散，同样取一厚度为dl的微元体，做底物的物料衡算：• 假定酶膜的面积为A，那么单位时间进入微元体底物量表示为• 单位时间流出微元体的底物量为• • 单位时间内微元体内反响的底物量为分散方向 对底物进展物料衡算：流入－流出＝反响耗费同样，底物沿分散方向的浓度分布与rs的方式有关，当酶膜完全浸在反响液中时，假设 ，同样进展无因次化处置，令 那么上式变为 ，同样给定边境条件：同样此方程只需数值解，没有解析解。
当 ，无因次化处置得 ，解得 当 同样也存在临界厚度的问题： 3.3.4 内分散有效因子•内分散有效因子的定义•一级反响动力学表达式•有效因子的普通表达式•零级反响表达式 3.3.4.1 有效因子的定义•定义：• 在稳态条件下，RS应等于从颗粒外外表处向微孔分散的速率，即• 当无外分散影响时， ，对于球状固定化酶， 3.3.4.2 一级反响•当 ，• •即•而对于片状固定化酶 固定化酶外形对有效因子的影响•随着 的添加， 下降，当 ，为动力学控制区，阐明内分散阻力很小，但当 >3时，内分散阻力明显，内分散成为控制步聚，此时• ，为过渡区。
• 此外，固定化酶几何外形不同，对 关系影响不大，特别是在 较小或较大时 3.3.4.3 有效因子的普通方式•当 •对于球状固定化酶，进展无因次化处置， •那么•由于S~r之间无解析解，因此 亦无解析解，因此• 由此可看出，当 添加时， 下降，而 ，从中可以看出影响泰勒模数的要素：1〕颗粒大小或厚度，即 ，对 的影响明显， 又称为特征尺寸， 越大， 值越大， 越小，因此为了减少内分散的影响的限制，反响中应尽能够采用小颗粒2〕颗粒活性，即动力学参数3〕有效分子分散系数 3.3.4.4 零级反响动力学•对于零级反响动力学，只需整个球形固定化酶颗粒内部有底物存在，反响就可以进展，此时， 假设由于内分散的影响，使得底物在固定化酶颗粒某一位置r处浓度为0，那么定义一个零级反响的泰勒模数 ， 来计算零级反响的有效因子，定义：•对于球形固定化酶，• 3.3.5 表观泰勒模数•定义： ，对于球形固定化酶，由 得•当 3.4 分散影响下的假象•分散影响的断定•分散对反响级数的影响•分散对活化能的影响•分散对固定化酶稳定性的影响 3.4.1 分散影响的断定•直接法：假设在一样的反响条件下，只改动底物的流速，假设流速改动，底物的转化率也随之改动，阐明存在外分散的影响，继续提高流速，转化率不再改动，阐明消除了外分散的影响，在此根底上，维持一样的反响条件，只减少固定化酶的特征尺寸，随着特征尺寸的减少，，底物的转化率添加，阐明存在内分散的影响，继续减少特征尺寸，直究竟物的转化率不变，阐明内分散的影响消除。
•图解法：根据Arrhenius定理，• 因此假设存在内分散的影响，那么活化能减半，假设受外分散的影响，活化能为0 3.4.2 分散对反响级数的影响•假设酶反响的本征动力学可表示为 ，假设只需内分散有影响，那么 ，两边取对数得• ，假定温度不变，K为常数，两边求导• ， 同样• ，因此•当无内分散影响时，•当内分散影响严重时，•当反响为外分散控制时，不论n为多大，表现反响级数均为1 3.4.3 内分散对活化能的影响•以一级不可逆为例： ，当内分散影响严重时，•K及Des与温度的关系均可用阿氏定理表示， 3.4.4 分散对固定化酶稳定性的影响•当只需内分散影响时， ，• 假定酶的失活是由于活性酶总量下降引起的，而k+2不变，那么•对于球形固定化酶， 令 假设酶的失活为一级失活，且为不可逆，那么 。