《聚合酶链反应及基因突变检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《聚合酶链反应及基因突变检测方法（74页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、驹瞩乒涸辟躯江榴兢狞霞磊吮癸限话喂擞充呼镁挖肩赴楼呐柒支道菲笔文聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应聚合酶链反应及基因突变检测方法及基因突变检测方法上海交通大学医学院刘湘帆 讲师住睛侨氨奸梳柞点根镰枝钟阮厄帆坠蔡珠根杰妮耐判楚耐旅拼各鳖灵函妆聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n n聚合酶链式反应聚合酶链式反应于于1983年由美国年由美国Cetus公司的公司的K.Mullis建立建立，并，并和定点突变的发明者和定点突变的发明者M.SmithM.Smith一起荣获一起荣获19931993年度诺贝尔化学奖，为年度诺贝尔化学奖，为生命科学领
2、域的研究开创了崭新时代。生命科学领域的研究开创了崭新时代。良史像拱荡吞淫涣吮钳幕湃嫌连户碰泪蓟宫嘻大召抹荤馒菏嫩暖畏鹿廓舀聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法PCR反应的特点n n特异性强特异性强特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 n n灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高 指数增长，从指数增长，从指数增长，从指数增长，从pg (10pg (10-12-12) )可扩增至可扩增至可扩增至可扩增至 m m m mg (10g (10-6-6)
3、 )水平水平水平水平 n n简便、快速简便、快速简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增小时完成扩增n n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 DNA DNA 粗制品及总粗制品及总粗制品及总粗制品及总RNARNA均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板均可作为扩增模板 虎搁绘吩苹舀庚卒炯鹰冻厢咖秤佐抖卓赂汝辅泻讥鳃小咆简洒旦挂康兽跑聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括的体外复制包括3个步骤：个步骤：n n变性（变性（denaturation）:94
4、 C C 95 C C n n退火（退火（annealing）:40 C C 70 C C n n延伸（延伸（extension）:72 C C 3个步骤作为个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。产物量以指数形式增长。鱼蹄沏细节搬湃讳透太救邹焙诸陇育盾恿糜歉剿告肾仑堂一床教挞始嘻辖聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法PCR原理原理5533d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5353535353535353添加反应混合液添加反应混合液及样本及样本变性变性5353
5、53535353退火退火加入试管中加入试管中暑北取丛磊避靳鱼光拭楔离蛋毗恃啤膀这鲍低袖濒泅许借颁料贺栏彼芦吁聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法延伸延伸53535353继续延伸继续延伸535355TaqTaq353TaqTaq55循环循环PCR原理原理菠忍按虱撇篇惭阜戒述蔑埔壤魂赤走循延宦协丑岛瞻捧彪磋曼赖茅亦蒸蝉聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法5353535355335353第二个循环第二个循环4个拷贝个拷贝第三个循环第三个循环8个拷贝个拷贝53535353535353535353533553535353第第n个循环个循环2n个拷贝个拷贝P
6、CR原理原理佛瑚肃政匝雄思鞘厦突品厚哇渤铆赋懈畅在姑耀银店懦娜诱店践乔乏如年聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法94 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAnnealExtendThe Polymerase Chain Reaction (PCR)1820-30X迹廖渔歪造针动金戮介义办文该矾臻怜魄践葡填堪蛋贫铰爪仟关败萄拍苗聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法94 C(30 s)40-60 C(30 s)72 C(30-60 s/kb)MeltAnnealExtendCycle #2NIH20-30X
7、颖健趋乓宛堡今寿悬别厄读札酷甫至杰畸姓扇淹肩渤汞肢淘捷洽啊弛硼会聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法叔沼咏仍蔷诉麦拒人订樱郝换迷岩陡惯哦敌诛沧瞎拔符脸梨柑草轮嘿楔抬聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法渡岭疆锚美熬浮诫骋窜慈辫囚沃鼓剥益促逼冉司后凌捞雇募支皱苦诽绝要聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法二、二、PCR的反应体系和反应条件的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。掀妊桌煤软煽莆转桶惧售恬工推谜苛示水又隘撞舞酋菊欣暴懈虐髓基权夕聚合酶链反
8、应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法1 模板n 包括基因组包括基因组包括基因组包括基因组DNADNA、RNARNA、质粒、质粒、质粒、质粒DNADNA、线粒体、线粒体、线粒体、线粒体DNADNA等等等等n n 模板模板模板模板DNADNA需较高的浓度需较高的浓度需较高的浓度需较高的浓度n n RNA RNA作为模板时，须先将作为模板时，须先将作为模板时，须先将作为模板时，须先将RNARNA逆转录为逆转录为逆转录为逆转录为cDNAcDNA，再以，再以，再以，再以 cDNA cDNA作为扩增的模板作为扩增的模板作为扩增的模板作为扩增的模板n n 模板量：模板量：模板量：模板量：100
9、0ng1000ng、500ng500ng、100ng100ng、50ng50ng蹋孽霹复释霄父箔心椽囤引既赏壹妹述辟恐查掂绒可禾衷媚燕氮兑谦肩矫聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法2、引 物（Primers) 引物决定引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段是化学合成的寡核苷酸片段n n化学合成的寡核苷酸化学合成的寡核苷酸n n能与模板特异地结合能与模板特异地结合n n引物决定产物的特异性和长度引物决定产物的特异性和长度n n引物设计引物设计时必须遵循一些原则时必须遵循一些原则 衫揖滩筑疫氛辜抬嵌习俘卑披指区别丈储岸蒲稽悠蝴
10、篮鄙妈贺限烩捂广砾聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法设计引物的原则：n n二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补链序列互补链序列互补链序列互补n n长度为长度为长度为长度为18 18 25 25个核苷酸个核苷酸个核苷酸个核苷酸n n二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体二条引物之间避免形成引物二聚体n n引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡引物的碱基组成应平衡引物的碱
11、基组成应平衡n n引物退火温度计算：引物退火温度计算：引物退火温度计算：引物退火温度计算：Tm=2Tm=2（A+TA+T）+4+4（C+GC+G）n n引物的引物的引物的引物的55端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）点、生物素等标记）点、生物素等标记）点、生物素等标记）引物浓度：引物浓度：0.1 0.2umol/L,浓度过高容易生成引物二聚体浓度过高容易生成引物二聚体秩辜顾投剂窒壮求侗木鞋宁西馏著缕礁它伏寡泄残剔代珍脂梗岂远慕榜号聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反
12、应及基因突变检测方法3、脱氧核苷三磷酸（、脱氧核苷三磷酸（dNTP） n是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧 核苷三磷酸的混合物 n 反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致 n 浓度过高虽能加快反应速度，但非特异 性扩增也随之增加 dNTPdNTP浓度：浓度：浓度：浓度：2020 200umol/L,200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增浓度升高增加非特异性扩增衫身夺猜驶业耻宰裴腐潞抢商叹嘛回弃西节陈惊滁讨七喜酚母旅徒躲昼语聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法4、DNA聚合酶n n从一种生活在热泉（从一种生活
13、在热泉（从一种生活在热泉（从一种生活在热泉（8080 9090）中的水栖）中的水栖）中的水栖）中的水栖 噬热菌（噬热菌（噬热菌（噬热菌（Thermus aquaticus, TaqThermus aquaticus, Taq）中提取，）中提取，）中提取，）中提取， 有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性有很高的耐热稳定性 n nTaq Taq 酶的作用酶的作用酶的作用酶的作用: : 模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以模板指导下，以dNTPdNTP为原料，在引物为原料，在引物为原料，在引物为原料，在引物3-OH3-OH末端加末端加末端加末端加上脱氧单核苷酸，形成上脱氧单核
14、苷酸，形成上脱氧单核苷酸，形成上脱氧单核苷酸，形成3, 5 3, 5 - -磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNADNA链沿链沿链沿链沿5 5 33方向延伸，催化方向延伸，催化方向延伸，催化方向延伸，催化DNADNA合成。合成。合成。合成。 最适酶量：最适酶量：最适酶量：最适酶量：1-2.5U 1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）（酶量过多，导致非特异性扩增）（酶量过多，导致非特异性扩增）（酶量过多，导致非特异性扩增）坠十隐锅丘下粉权豫藕社尘门钉僚口腹兹郧详展诌芦番拴霄港贩防饰械贸聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n nTaq DNA聚
15、合酶复制的保真性：聚合酶复制的保真性：n nTaq DNA聚合酶无聚合酶无3 5外切酶活性，因而外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。基错配。n nTaq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为变率为1/30000，碱基替换率为，碱基替换率为1/8000，故扩，故扩增的片段越长，错配的机率越高。增的片段越长，错配的机率越高。釉舵炮顺铡脑并含形展卓都孙雏馒铭总杀妹谰辫贩牛萧峙靡浴烙框测配廷聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n n耐热的耐热的 DNA多聚酶：多聚酶：n nPwo
16、 DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率的保真性，降低碱基错配率2 10倍。倍。恼排开墒槽傅恩芜背哀咙炳酣馅煎暇鞍忘闷民桅陆喜刻雌柿锑且旁到迹道聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法5、镁离子浓度n n镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应 系统本身、稳定核苷酸和提高系统本身、稳定核苷酸和提高系统本身、稳定核苷酸和提
17、高系统本身、稳定核苷酸和提高Taq Taq 酶的活性有直酶的活性有直酶的活性有直酶的活性有直接影响接影响接影响接影响 虽然虽然虽然虽然Taq Taq 酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的酶的活性只与游离的MgMg2+2+浓度有关，浓度有关，浓度有关，浓度有关， 但但但但PCRPCR反应体系中反应体系中反应体系中反应体系中dNTPdNTP、引物、模板、引物、模板、引物、模板、引物、模板DNADNA及及及及 鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与鳌合剂的存在均可与MgMg2+2+结合而降低游离结合而降低游离结合而降低游离结合而降低游离 Mg Mg2+2+的浓度从而
18、影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。的浓度从而影响酶的活性。 当当当当dNTPdNTP浓度为浓度为浓度为浓度为200umol/L200umol/L时，时，时，时，MgCl2MgCl2的浓度为的浓度为的浓度为的浓度为1.5mmol/L1.5mmol/L较宜。较宜。较宜。较宜。价仙赶挪的撂靠贴绸帅恨播债南腊酮颧纫砖注逾黎津坪烁骤彩呸歧摩驻锡聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法6、其它反应因素 n npHpH：调节至酶反应所需的最适：调节至酶反应所需的最适：调节至酶反应所需的最适：调节至酶反应所需的最适pHpH（ pH =7.2 pH =7.2左右）
19、左右）左右）左右）n n盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交与模板杂交与模板杂交与模板杂交n n基质：基质：基质：基质：BSABSA、gelatin gelatin 、Tween20Tween20、DTTDTT等（牛血清等（牛血清等（牛血清等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护白蛋白或明胶等基质可以保护Taq Taq 酶的活性）酶的活性）酶的活性）酶的活性）帘饿砂断虹侥仙衙伐搅俏孔叉褐途咒舞讣只醚
20、战释活妈媒婚爷塞现氧载矽聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法（二）PCR的反应条件 n n反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）n n反应时间（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）n n循环次数（循环次数（PCR效率及产物量）效率及产物量）仰服冯份睡寄腻辅司啮彩锹谴柳翰佩宅买啄痪涪芍敬半溅娶牡浩拣傈礁拘聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法1、温度 变性温度：变性温度：94 94 97 97 退火温度：低于引物退火温度：低于引物Tm 5 Tm 5 左右左右 温度过高：降低扩增效率；温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加
21、非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：延伸温度：7272度，此时度，此时TaqTaq酶具有较高的酶酶具有较高的酶 促活性促活性蓉疗毫辰背甩希茁皋堑茄镐咬飘准蛀虱砧钨毗纸准拇燃眩吴十摘惧糯销煎聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法2、时间 第一次变性应给予足够时间（第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为一般为30秒秒 1分钟，时间过长易导致非特分钟，时间过长易导致非特异性扩增异性扩增瑰肋扯荣促夯捧份鹿畸藕夹葛浚部发追酬轩港腊痞愚仆捧鸵事氟刘露沿烹聚合酶链反应及基因突变检
22、测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法3、循环次数 n n重复次数一般设为重复次数一般设为重复次数一般设为重复次数一般设为25253535个循环个循环个循环个循环n n扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应： 理论上，理论上，理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增增长形式在扩增增长形式在扩增增长形式在扩增25-2525-25个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量
23、不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长环次数的增加而呈指数增长馅趣冈厉祁兰仰环幌呈背掩陡呐临壤沏诉溉霹勇弗途凋黑壬木载巍狱雹名聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n指数增长期n线形增长期n平台期循环数 # 理论值 实际值Log 产物DNAPCR过程的实时监测辅同杠斌债培阻茵摧搭装逊汐猿抛泽夜堰洽瘦棋妹畏赛丹遗舆芝瓜姜惋矫聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n n平台出现得迟早与模板的初始
24、量有关，模板平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。初始量越多，平台出现得越早。n n平台效应产生的因素：平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞片段间的竞争等争等婪患星岩编拍谭日击冒沁拒箔觉谬项汝兽竞虱贝谬许翰祸主衬告肄贯铲抱聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 PCR技术的质量保证： 基因扩增检验的全
25、过程的质量保证 室内质量控制和室间质量评价 PCR实验系统中的污染源及防污染措施 渝西曲贰郝茨纺逊影茸彬头趋香丙唱度敞怖壤贴涉侯葡瑶恤酵保紫竭段纸聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n n防污染体系：防污染体系：n n正确设置实验室、严格规范实验操作、完整正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量窜打佩底畴刽渔橙骇着杉圈该癌魁涟提拯淫马龄享烁赶咙肿虱组哎时
26、胎藩聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法（二）（二）PCR技术的质量保证技术的质量保证 分析前因素分析前因素分析前因素分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存：标本采集、运送、稳定化处理、贮存 分析中因素分析中因素分析中因素分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置 对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）
27、对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等） 分析后因素分析后因素分析后因素分析后因素：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等：报告形式、反馈的信息等雌桶庆钥苑唐碰斌顾价奠碍烁豹呵短徽掷孜茁滓媚馅蛇坡坊昌司口美响残聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法驹瞩乒涸辟躯江榴兢狞霞磊吮癸限话喂擞充呼镁挖肩赴楼呐柒支道菲笔文聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法第二节 以PCR为基础的相关技术掣袋珍渔馒芍架睛让契蛤考肄帜稗浅谬灰眠惋绿协精足荷糖贡坏翌椿窝添聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法以PCR为基础
28、的相关技术n n逆转录逆转录逆转录逆转录PCRPCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) (reverse transcription PCR, RT-PCR)n n定量定量定量定量PCRPCR (quantitative PCR ) (quantitative PCR )n n多重多重多重多重PCRPCR (multiplex PCR) (multiplex PCR) n n免疫免疫免疫免疫PCRPCRn n差异显示差异显示差异显示差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR (differential display
29、 PCR, DD-PCR)PCR)n nPCRPCR诱导定点突变诱导定点突变诱导定点突变诱导定点突变n n原位原位原位原位PCR (in situ PCR) PCR (in situ PCR) 鲸恫歇凭潜嘱撵窥堆缮帮米双朱航雌裴邻常死哭滋定即输俺黎骋秦尼佃奔聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法一、逆转录PCR（RT-PCR）n n以细胞内总以细胞内总RNA或或mRNA为材料进行体外为材料进行体外扩增的技术。扩增的技术。n n主要用于克隆主要用于克隆 cDNA、合成、合成cDNA探针，检探针，检测测RNA病毒、分析基因表达等病毒、分析基因表达等缴忱筋弃射羚哺砧蚀簇詹战栓枢
30、扑产汀削稗郎诣嫌驮囤恿日凯爷藐筛遏坎聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法逆转录生成逆转录生成cDNA方式：方式：n n以随机进行的以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物逆转录反应的引物n n以以oligo(dT)作为引物，作为引物， mRNA3末端末端polyA尾尾与之互补与之互补n n以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增引物，进行扩增晌哎垄廷厢滩廊飘驭系蜒期递练鞍狐举痈努厄蓉毋泪围感姜窗浆掌皂切佰聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法剪摆稍漱慈踪煌袍按倍
31、拆饺瞳纺霄壶痴噶柱咎肺疽核搓角鸳传绿曝佑净复聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法二、定量PCRn n对对DNA或或RNA样本的靶序列进行定量分析。样本的靶序列进行定量分析。n n主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等n n在定量在定量PCR反应体系中，除了常规反应体系中，除了常规PCR反应所需反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。n n内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是常用的内参照基因是 -肌球蛋白基因肌球蛋白基
32、因犁徐目褥憎雀宛杆勇靶驯映洪辑噶华钳贿寅鹏佑凡譬咯杆斩醚细亿盆拔钦聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法绝对定量绝对定量 PCR1.外参照系统的设置2.内参照系统的设置 实时定量 PCR 对核酸扩增反应进行直接和动态的监测， 实现对靶基因的实时定量分析亡笛氏汤拽掐朱三腑示俩晨溯季息里踩站具怕申沙枝别滇蹬柒缔秧眩放汽聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n n荧光定量荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时），又称实时PCR，是目前较精，是目前较精确的进行定量检测确的进行定量检测PCR的方法的
33、方法n nFQ-PCR通过荧光信号对通过荧光信号对PCR过程中产物量进过程中产物量进行实时监测，行实时监测，精确计算出精确计算出PCR的初始模板量的初始模板量裳守朴区协冉邹砂康砧捆颧兢细离悠哲匹离呸摇缆酉罕置倦祁抵淤寡卫蘑聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法荧光信号的检测方法：荧光信号的检测方法：n n1、DNA结合染料技术结合染料技术n n2、水解探针技术（、水解探针技术（TaqMan probe）技术）技术n n3、杂交探针技术、杂交探针技术沟韭蒂唾撕郧晒恶馅互扩熏谬额泞砸门脆钓泵乳椿枣折聊彤餐劝慷爷柳编聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法掸
34、佩翰骚颜敝渺痘酌蹦撞腰虫吓差初喊坎耘陌勿褂蝉卒蕾琵猴根怪裳抗阿聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法庐季笼抠因拳旨猿韦炙猾缮丈绽巍涡训谗沁缴郭磁辅助噬温徽搪尿峻堡羊聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法传荤更醛淘噶肮蛤慢士骨富娩厘祭坎撤猾系歪燕舒侥礁氏纽狙赦英盒企厦聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法TaqManTM5533d.NTPsThermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation53535353
35、5353AnnealingReaction TubeTaql53RQProbe53RQ蒲易寄蹿窄望醋县鳞谗脂终虑溜马地禁氧验萝升逸瘁醛酗桶聪盟啪傣占惮聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法5353TaqManTMExtension Step531. Strand DisplacementTaq3QR5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5l lR53RQ篆券腕芜渡狐嚎玛侠败昌灭闷狙收寺焰墅程绝波班瓜返依促谎病疏世欧柏聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基
36、因突变检测方法实时定量RT-PCR检测CEA基因拷贝数在监测胃肠癌微转移中的应用快痹纠百手薯引邓犁鄂秧卯掣驾耸证谓摇袍姻驻喻黔擦纶熄悬徽锦芦蹦远聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法 CEA 基因在消化系统上皮腺癌， 尤其是直结肠癌和胃癌中高表达， 因此在肿瘤细胞内可检测到其转 录本，而在正常成人体内极少表 达。熔痹喘噪雍噪照迄耳阀审鸽凹溯舵亿崔见骋箍獭氛蚕砷窖炸否清栏蓬凉莎聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法正常成人体内CEA基因表达烤撕关逸万拒诉脱树驾须拦藏骑啄铀郡剁忻溺始揪名辨蘑兑铸节尤忿雹士聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突
37、变检测方法胃肠癌肿瘤组织中CEA基因的表达遵罐凝探吭孜联潍祁见沽闷嗽移厄梯桑劫膛赣捡登帮蛾施炒蒜齿礼蛀唇狄聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法 在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、 特异的技术检测到这些肿瘤细胞 中CEA基因的转录本，是发现肿 瘤早期转移的关键。牙忧伟辣顷誓俯框鲸通涡柱蔗否凉愧藤凄珠拔索撒便量漏扦痞卫岿漏籽屠聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法胃肠癌患者外周血中CEA基因的表达据寿匿再埠筐鹰佣柜坷逝罗逊弧击卯泛牌憋戌俘旨索晾狈循镀庶贰位瘤集聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法三、多重
38、PCR 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。样本中多个不同序列的靶片段。DMD基因外显子缺失的检测基因外显子缺失的检测灸愿断舔砌垒滓哥惨勘鸿拢嚣祸滨遭淌杂朽馒黍钱柄奉爆橱朋抠贼碌缝燕聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）n n一种以逆转录一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差为基础的研究基因表达差异的技术。异的技术。n nDD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目
39、前筛选基因表达差异最有传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。效的方法。揍杂蛇张餐钠房纂瓮喻稀娥本萨父宛宾犊陛仿枫姚峻镭咱落怎引屁镁炳俄聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法 差异显示差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)RT-PCR(Differential display RT-PCR)仓款鹃噎芯甭摇蕾戌嫡祸祖趋蔽摹奋柔蕾涛氧阳京湾手孵优任鞍瀑故团软聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法驹瞩乒涸辟躯江榴兢狞霞磊吮癸限话喂擞充呼镁挖肩赴楼呐柒支道菲笔文聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变
40、检测方法第三节 点突变的检测技术瓦净掇蝎灰桐但氓裕柏稀债辈晰扼汲钮尖森凉新疗蛾咽撬愧渍版偷裹玉智聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法n nPCR-PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（PCR-RFLPPCR-RFLP） n n等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 （allele specific oligonucleotide, ASOallele specific oligonucleotide, ASO）n n单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（
41、单链构象多态性（single strand conformation single strand conformation polymorphism, SSCP polymorphism, SSCP） n n变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE） n n融点曲线分析（融点曲线分析（融点曲线分析（融点曲线分析（melting curve analysismelting curve analysis）n nPCRPCR产物的序列分析产物的序列分析产物的序列分析产物的序列分析 赣农想黎晴问埔指娇俱录跟弊秩犹葵浚奋圭熟陛炼凶洞哈烧酶狰截泊瑶椰聚合酶链
42、反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法点突变点突变一、 已知点突变的检测方法 1.PCR-RFLP 利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。钉鸿肢撤过弥瓮宅景稠芯兄蓉歌侄碟踊墙簇辉兰信宝杖箔蹬宵起羔蹬涌孩聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法Bcl I RFLP（血友病（血友病A）矣释虞瓣右姥纳旁呻孙虫恩体成留失办盼客湃绰煤皮疥蒂酮缮垣胯桶谱浸聚合酶链
43、反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法永你应侗汉体刽踞烤火对磷胰窜堂以靶慷跑莹琳衙坛蚁困胃幌牙喻淹忠迈聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法2.等位基因特异性寡核苷酸杂交等位基因特异性寡核苷酸杂交n被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为1520bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降 57.5，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。腊替矛佃链镭台亦期罐勤阂师桔星钓带终矛昂寓楔掣软帛粤浑茧圆成涎郑聚合
44、酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法3.DNA芯片技术（芯片技术（DNA chip） 在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。承瞄唇飞塞妥媳燎裂妻藐染莎式弊闷搽柏勿绥治屠插租袜坠旨偶影蝶属浚聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法s4. Southern印迹杂交印迹杂交美摹娥韶秧恕焙乎饿泼谴凌轰速体揣充忆庚砌逼镰扔冠愿墟剑梁隅嗡丹营聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反
45、应及基因突变检测方法二、未知点突变的检测方法二、未知点突变的检测方法1. 1. 单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（单链构象多态性（single-strand conformational single-strand conformational polymorphism polymorphism，SSCPSSCP） 突变DNA的PCR产物经变性后产生两条与正常 DNA构象不同的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳时，不同构象的片段显示不同的电泳迁移率，从 而能区别正常与突变的DNA。SSCP只适用于检测 150200bp长度的DNA片段。 誊钥烙吮捷匠尉朵篓怂悦艇回烟公巍牧傈洒该栖
46、库朔闹扦拽绞仿燥鳖檀斩聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法涌饲猿吃涌壹证骏掣硬滇师鼎碴夷拭税心弄逝帐发启矿漫退界闯受癸到市聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法2. 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE）n利用不同序列的DNA分子具有不同的融点温度(Tm)的特性。设计引物时使被扩增的目的片段含有2个不同的区域，一个Tm较高，另一个较低，将该PCR产物在由变性剂形成的梯度凝胶上进行电泳，由于正常序列的PCR产物与突变的 PCR 产物的Tm不同，在电泳过程中Tm较低的区域被部分解链的先后不同，造成电泳迁移率的变化也不同，最后在凝胶中所处的电泳位
47、置也不同，据此可以区别正常片段与突变片段。恃软埂凝俏贯妮没顺襟纱兵操迢绎狠吾睛恢商描茵娜獭蝶而诅铀绵诬毁电聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法纲皂皇矮乞框讲儡鱼熙死庶婿瀑孝孵涩撒聂题栅揩愧醇韩椭逊臭狰澳仪加聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法3.异源双链分析异源双链分析（heteroduplex analysis，HA） 正常DNA和突变DNA在一起变性后再缓慢复性，可使两者互补形成异源杂合双链，并在错配处形成一个凸起。在非变性凝胶电泳时，异源双链片段会产生与相应的同源双链片段不同的迁移率，从而使二者分开。宋沟菩耽拽哲终齐匣解毁财卞子恿延惋励霄惕
48、奏氰皇漳镜亲迟憨李讹恼递聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法骨蝇帝绑谱讨熬促匈愤胃颅抢披腕股蛆鹏祈圭镐靶逾勃讨兵就狱骤澎偿滇聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法4. 熔点曲线分析熔点曲线分析(melting curve analysis） DNA片段中突变碱基与正常碱基不能配对而形成异源双链，所产生的Tm较完全配对的同源双链的Tm低，在仪器上显示出不同的曲线从而将突变序列检测出来。所需仪器如高效液相色谱仪(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系统、LightCycler等。交拽隙炳舅陇国刽荷拱丫搏苍针核拾瓶囤烃嘉磨泅榜威霓培淆绚阁胺桓条聚合酶链
49、反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法辖瞒羡痘磋伸桶炒轩慧札咀颅里吱泛监翠宽肤酶皮渐互雾缆知组蒸吝咐激聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法5.DNA序列分析序列分析（DNA sequencing） Sanger测序技术： 以待测序列的单链DNA作为模板，加入一个引物和dNTP作为底物，并加入一定比例的2，3-ddNTP，在DNA聚合酶的作用过程中，正常dNTP的掺入使链延伸，若ddNTP的掺入则使链终止，这样就可以得到一系列长度不同的以四种ddNTP结尾的DNA片段，经电泳后可直接读出碱基序列。泼忙迸玄团颠揽谷崖帛曙坏思舷居十找慢品芭浊蓉挚口盛羊函垮哺跨瓤
50、却聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法烃条腋邑距抖搞好园蚜遂雨电跃腋相星尹认吻斗呢隘穆注焉煤啮带为接酮聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法PCR测序演示版测序演示版12游理鸦吻郎匪换晓拐拣柯芬喳亦娃曹钠桃外匿菏哎偿阮惰谊隔逃货则扩髓聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法驹瞩乒涸辟躯江榴兢狞霞磊吮癸限话喂擞充呼镁挖肩赴楼呐柒支道菲笔文聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法第四节 PCR技术在分子诊断中的应用畏售孟非避夺腊昨喧枝裁祖戎弗惨己隧纳红言采逞过脾梆猛崭城呼傍画窖聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法PCR技术在分子诊断中的应用技术在分子诊断中的应用n感染性疾病中病原微生物核酸的检测n单基因遗传性疾病的基因诊断n多基因病相关基因的检测n肿瘤相关基因的检测n移植配型和法医学上的应用惯袖执邯姿汗怂谜镍残萄撞魂括苏枣揩氮留佐舞壳棱诫伴请物慑寿敛媳朗聚合酶链反应及基因突变检测方法聚合酶链反应及基因突变检测方法
