黄酮类化合物的检识与结构鉴定

第四节　黄酮类化合物的检识与结构鉴定一、色谱在黄酮类鉴定中的应用一、色谱在黄酮类鉴定中的应用1.  纸层析(PPC)n n苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（正丁醇：  醋酸：水4：1：5上层）；第二相展开用水性溶剂，如氯仿：醋酸：水（3：6：1）   苷元则多采用醇性溶剂   花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂n n显色剂：2%三氯化铝甲醇液（紫外光下检测）；   1%FeCl3 / 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液2. 薄层层析(TLC)  １）硅胶薄层    用于弱极性黄酮较好    常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲醇（95：5）或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等   ２）聚酰胺层析n n适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类n n常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用n n可可用用于于确确定定黄黄酮酮母母核核类类型型及及确确定定某某些些位位置置是是否否含含有羟基n n一般程序：一般程序：       ①①测定样品在甲醇中的测定样品在甲醇中的UVUV谱以了解母核类型；谱以了解母核类型；         ②②在在甲甲醇醇溶溶液液中中分分别别加加入入各各种种诊诊断断试试剂剂后后测测UVUV谱谱和和可可见见光光谱谱以以了了解解3,5,7,3’,4’3,5,7,3’,4’有有无无羟羟基基及及邻邻二二酚酚羟羟基；基；         ③③苷苷类类可可水水解解后后（（或或先先甲甲基基化化再再水水解解）），，再再用用上上法测苷元的法测苷元的UVUV谱以了解糖的连接位置。

谱以了解糖的连接位置（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱n n多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成：   带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起BB带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起AA 带带II(240-285nm)（苯（苯甲酰系统）甲酰系统）带带I(300-400nm)桂皮酰系统桂皮酰系统类类   型型说说   明明  250-285304-350黄酮类黄酮类 -OH越多，带越多，带I带带II越红移越红移 B环环3’,4’有有-OH基，带基，带II为双峰（主为双峰（主峰伴肩峰）峰伴肩峰）328-357黄酮醇类黄酮醇类(3-OR) 352-385黄酮醇类黄酮醇类(3-OH) 245-270270-295300-400异黄酮类异黄酮类二氢黄酮二氢黄酮（醇）（醇）B环上有环上有-OH, OCH3对带对带I影响不大影响不大 220-270340-390或或340-390(Ia)  300-320(Ib)查耳酮类查耳酮类查耳酮查耳酮2’-OH使带使带I红移的红移的影响最大影响最大370-430(3-4个小峰个小峰)橙酮类橙酮类 不不同同类类型型黄黄酮酮类类化化合合物物的的紫紫外外光光谱谱2．加入诊断试剂后引起的位移及结构测定加入试剂带II带I说明样品+MeOH（黄酮类及黄酮醇类）250-285304-385两峰强度基本相同，具体位置与母核上电负性取代基(-OH, -OCH3)有关，-OH, -OCH3越多，越长移   +NaOMeA环 有 -OH，红移 小 ，无意义40-60nm（不变或增强）50-60nm（下降）有4’-OH，无3-OH 有3-OH，无4’- OH有3,4’-OH或3,3’,4’-OH（衰减更快）  7-OH带I，II随加NaOMe时间延长，逐渐衰减 320-330nm有吸收，成苷后消失+NaOAc(未熔融)5-20在长波一侧有明显的肩峰7-OH+NaOAc(熔融) 40~65有4’-OH+NaOAc/H3BO35-1012-30有6,7-OH或7,8-OH (5,6-OH无)B环有邻二酚羟基  AlCl3/HCl 6050-6035-5517-200有3-OH有3,5-二OH有5-OH，无3-OH有6-OR无3-OH, 5-OHAlCl3光 谱 -AlCl3/HCl光谱 30-4050-650B环有邻二酚羟基A,B环皆有邻二酚羟基A,B环皆无邻二酚羟基说明：（1）+NaOMe或NaOAc, OHONa，变为离子化合物，共轭系统中的电子云密度增加，红移   另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH时，在NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。

2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4’-OH解离（3）形成络合物的能力：黄酮醇3-OH >黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）> 邻二酚羟基 > 二氢黄酮醇5-OH邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多（（4 4））   根据只加根据只加AlClAlCl3和加入和加入AlClAlCl3及盐酸的紫外光及盐酸的紫外光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟基的取代情况的取代情况                                                          山柰苷山柰苷                          山柰酚山柰酚UVλmax(nm)    UVλmax(nm)    带带II   II   带带I I                    带带II  II  带带I IMeOH MeOH                  265                    265   345345          267             267   367367NaOMe NaOMe                265                  265   388388          278             278   416416（分解）（分解）AlCl3AlCl3                   275                      275   399399          268             268   424424AlCl3/HClAlCl3/HCl           275              275   399399          269             269   424424NaOAcNaOAc                 265                   265  399399          276             276   387387NaOAc/HNaOAc/H3 3BOBO3 3       265       265   345345          267             267   367367从中药柴胡中分离得到山柰苷，经酸水解后，用PC检出有鼠李糖，山柰苷及山柰酚的紫外光谱数据如下：山柰酚3，7-二鼠李糖苷三、1H-NMRn n常用溶剂：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲 基 亚 砜 （ DMSO-d6） ， 氘 代 吡 啶（C5D5N）。

n n也可将黄酮类化合物制成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定黄酮类化合物1H-NMR谱(DMSO-d6)羟基的特征δ5－OH：≈12 ppmδ7－OH：≈11 ppmδ3－OH：≈10 ppmn n氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）对鉴别黄酮母核上的酚羟基，是十分理想的溶剂，在试样中加入重水（ D2O）羟基质子信号消失（一）A环质子1．5, 7-二-OH黄酮    黄酮类1H-NMR（三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中测定）n n当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低场方向位移2．7-OH黄酮H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮在较低场，且相互位置可能颠倒 （二）   B环质子 δ6.5-81．4’-氧取代黄酮类化合物H-3’, 5’   6.5-7.1, d, J=8.5HzH-2’, 6’   7.1-8.1, d, J=8.5Hz由于C环对H-2’, 6’的负屏蔽作用大于对H-3’, 5’，   且H-3’, 5’受4’-OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2’, 6’处于越低场的位置。

2．3’, 4’-二氧取代黄酮类化合物 H-2’受C环负屏蔽和3’-OR屏蔽作用，H-6’ 也受C环负屏蔽作用，而H-5’则仅4’-OR屏蔽作用故由低场到高场的顺序为：H-6’ H-2’ H-5’但有时也会发生H-2’和H-6’重叠的现象1）3’, 4’-二氧取代黄酮及             黄酮醇H-5’   6.7-7.1  d, J=8.5HzH-2’   7.2  d, J=2.5HzH-6’   7.9  dd, J=2.5, 8.5Hz（2）3’, 4’-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及   二氢黄酮醇    H-2’, 5’,6’常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰） 6.7-7.13．3’, 4’,5’-三氧取代黄酮类化合物若R1=R2=R3=H，则H-2’,6’为单峰， 6.7-7.5若上述条件不成立（如3’或5’甲基化或苷化时），则H-2’,6’分别为二重峰（J=2Hz） （三）（三）   C环质子环质子   1. 黄酮类黄酮类2. 异黄酮类H-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，δ7.6-7.8。

若用DMSO-d6作溶剂，则δ8.5-8.7 3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇    1) 二氢黄酮两个H-3, 分别为dd峰，中心位于δ2.8 ，J = 17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J = 17Hz（偕偶），11Hz（反偶）H-2, dd, δ5.2, Jtrans = 11Hz（反偶）, Jcis = 5Hz（顺偶）（2）二氢黄酮醇3-OH苷化，供电子能力下降，两个氢的δ值升高（向低场位移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置 H-2与H-3为反     式双直立键，     J=11HzH-2  δ 4.9H-3  δ 4.3H- α ： δ 6.50-6.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 )H- β ： δ 7.30-7.70 ( 1H,d, J=Ca.17.0 )查耳酮：苄氢苄氢:δ6.50-6.70( 1H,s )         δ6.37-6.94( 1H,s, DMSO-d6 )橙酮：（四）  糖上的质子  1. 单糖苷类   糖与苷元相连时，糖上1˝-H与其它  H比较，一般位于较低磁场区因-OR (R=苷元) 不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（4.0-6.0）1）葡萄糖位于不同位置时端基H化学  位移的区别：   C3-OR      1˝-H的 值约为5.8   C-5, C-6, C-7, C-4’-OR                        1˝-H的 值约为4.8-5.22) 葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别   黄 酮 醇 3-O-葡 萄 糖 苷 5.8,  d,             J=7Hz （二直立键偶合系统）   黄 酮 醇 3-O-鼠 李 糖 苷 5.0-5.1,  d, J=2Hz （二平伏键偶合系统）   另外鼠李糖上的C-CH3    0.8-1.2, d, J=6.5Hz  化合物化合物  糖上的糖上的H-1’’黄酮醇黄酮醇3-O-葡萄糖苷葡萄糖苷5.70-6.00黄酮醇黄酮醇7-O-葡萄糖苷葡萄糖苷            4.80-5.20黄酮醇黄酮醇4'-O-葡萄糖苷葡萄糖苷  黄酮醇黄酮醇5-O-葡萄糖苷葡萄糖苷                           黄酮醇黄酮醇6及及8-C-糖苷糖苷黄酮醇黄酮醇3-O-鼠李糖苷鼠李糖苷                       5.00-5.10二氢黄酮醇二氢黄酮醇3-O-葡萄糖苷葡萄糖苷               4.10-4.30二氢黄酮醇二氢黄酮醇3-O-鼠李糖苷鼠李糖苷               4.00-4.20糖上的氢 2. 双糖苷类n n末端糖上的H-1’’’因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而较H-1’’处于较高场的位置。

      取代基取代基  δ              甲基甲基        2.04-2.45 ( 3H,s )          乙酰氧基乙酰氧基        2.30-2.45 ( 3H, s )             甲氧基甲氧基        3.45-4.10 ( 3H, s )苯环上其他取代基的氢：四、13C-NMR   方法：   （1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较；   （2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算；   （3）选用各种一维和二维NMR技术（一）骨架类型的判断n n根据中央三碳链的碳信号，即先根据羰基碳的δ值，再结合C2、C3在偏共振去偶谱中的裂分和δ值判断C=OC-2（或（或C-β））C-3（或（或C-α））归属归属 174.5~184.0(s)160.5~163.2(s)104.7~111.8(d)黄酮类黄酮类149.8~155.4(d)122.3~125.9(s)异黄酮类异黄酮类147.9(s)136.0(d)黄酮醇类黄酮醇类182.5~182.7(s)146.1~147.7(s)111.6~111.9(d)(=CH-)橙酮类橙酮类 188.0~197.0(s) 136.9~145.4(d)116.6~128.1(d)查耳酮类查耳酮类75.0~80.3(d)42.8~44.6(t)二氢黄酮类二氢黄酮类82.7(d)71.2(d)二氢黄酮醇二氢黄酮醇类类（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法 n n黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。

n n以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示： 1．取代基位移的影响．取代基位移的影响 XZiZoZmZpOH26.6-12.81.6-7.1OCH331.4-14.41.0-7.8-OH及-OCH3的引人将使直接相连碳原子(α-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(β-碳)及对位碳则向高场位移间位碳虽也向低场位移，但幅度很小n nA-环上引入取代基时，位移效应只影响到A环，而B-环上引入取代基时，位移效应只影响到B环若是一个环上同时引入几个取代基时，其位移效应将具有某种程度的加和性n n黄酮母核上引入5-OH时，不仅影响A环碳原子的化学位移，还因C5-OH与C4=O形成分子内氢键缔合，故可使C4，C2信号向低场移动(分别为+4.5及+0.9)，而C-3信号向高场移动(–2.0)C5-OH如果被甲基化或苷化(氢键缔合遭到破坏)，则上述信号将分别向高场位移 2．5，7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征  n n对对大大多多数数5 5，，7—7—二二羟羟基基黄黄酮酮类类化化合合物物来来说说，，C-C-6(d)6(d)及及C-8(d)C-8(d)信信号号在在δ90δ90．．0 0～～100100．．0 0的的范范围围内内出出现现，，且且C-6C-6信信号号总总是是比比C-8C-8信信号号出出现现在在较较低低的的磁磁场。

场n n在在二二氢氢黄黄酮酮中中两两者者差差别别较较小小，，约约差差0 0．．9 9个个化化学学位位移移单单位位，，但但在在黄黄酮酮及及黄黄酮酮醇醇中中差差别别较较大大，，约约为为4.84.8n nC-6C-6或或C8C8有无烷基或者芳香基取代可通过观察有无烷基或者芳香基取代可通过观察13C-NMR13C-NMR上上C-6C-6，，C-8C-8信号是否发生位移而加以信号是否发生位移而加以认定   生松素(pinocembrin)及其6-C-甲基及8-C-甲基衍生物的C-6，C-8化合物化合物C-6C-85,7-dihydroxyflavanone(pinocembrin)96.195.16-C-methylpinocembrin102.194.78-C-methylpinocembrin95.7101.9化合物化合物C-6C-83',4',5,7-tetrahydroxyflavanone(luteolin)99.294.28-C-benzylluteolin98.6103.86-C-hydroxyluteolin140.493.6木犀草素(1uteolin)，即使因其C6上联接的H被-OH取代而向低场大幅度的位移，C-8信号也未因此而发生大的改变。

(三)黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置1．糖的苷化位移及端基碳的信号  n n酚性苷中，糖上端基碳的苷化位移约为+4.0～+6.0n n黄酮苷类化合物当苷化位置在苷元的7或2’、3’、4’时，糖的C-1信号将位于约δ100.0～102.5范围内n n5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相应的C-1信号分别出现δ104.3及99.0处.n n黄酮类双糖苷或低聚糖苷的13C-NMR中，糖的端基碳信号出现在δ98.0～109.0区域内，常与C-6，C-8，C-3及C-10混在一起而不易区别可采用HMQC (1H-detected heteronuclear multiple-quantum coherence)等二维核磁共振技术鉴别2．苷元的苷化位移  n n苷元苷化后与糖直接相连碳原子向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大而且恒定n nC-5-OH糖苷化后，除上述苷化位移效应外，还因C5-OH与C4＝O的氢键缔合受到破坏，故对C环碳原子也将发生巨大的影响C2，C-4信号明显地向高场位移，而C-3信号则移向低场(四)双糖苷及低聚糖苷中分子内苷键 及糖的联接顺序 （1）当糖上的羟基被苷化时将使该-OH所在碳原子产生一个相当大的向低场位移。

n n例如在黄酮类化合物芦丁[苷元-O-β-D-glucosyl-(6→1)-α-L-rhamnoside)中，葡萄糖的C6信号将向低场位移5.8，但C-5则向高场位移约1.4（2）黄酮类双糖苷及低聚糖苷中糖的联结顺序常采用HMBC(1H-detected heteronucler multiple-bond-coherence)二维核磁共振技术进行确定五、质谱在黄酮类结构测定中的应用n n多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定n n但是当测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，则采用FD-MS和FAB-MS、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰[M]+及具有偶数电子的准分子离子峰(quasi-molecularion peak) [M+H] + (一)黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱                       (El-MS)n n黄酮类化合物苷元的El-MS中，除分子离子峰[M]+外，也常常生成[M-1]+即(M-H)基峰如为甲基化衍生物，则可以得到[M-15]+即(M-CH3)离子。

黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：途径途径-I -I（（RDARDA裂解）：裂解）：                                            120                             102                                            120                             102   途径途径-II此外，还有分子离子M+.生成[M-1]+，(M-H)及[M-28]+.(M-CO)；由A1生成[A1-28]+.，(A1-CO)及B2生成[B2-28]+，(B2-CO)等碎片离子 1．黄酮类裂解基本规律：．黄酮类裂解基本规律：化合物A1+.B1+.黄酮1201025，7-二氢黄酮1521025，7，4'-三羟基黄酮（芹菜素）1521185，7-二羟基，4'-甲氧基黄酮（刺槐素）152132A-环的取代图式可通过测定A1+.的m/z的值进行确定 同样，根据B-环碎片离子的m/z值，也可精确测定B环的取代情况 一些黄酮类化合物的质谱数据 黄酮在有四个以上氧取代基时，常常给出中等强度的A1及B1碎片，它具有重要的鉴定意义；但是黄酮醇则不然，当氧取代超过四个以上时，只能产生微弱的Al+.及Bl+.碎片离子。

 n n在3，6及8-位含有C-异戊烯基的黄酮类，除一般黄酮裂解途径外，还产生一些新的碎片离子如：化合物(I)中A环上的，-二甲烯丙基在裂解过程中脱去C4 4H7 7·碎片，并重排成稳定的卓瓮离子(Ⅱ)           在在6-6-及及8-8-位位含含有有甲甲氧氧基基的的黄黄酮酮可可失失去去CHCH3 3· ·，，得得到到[M—15]+[M—15]+强强峰峰( (常常为为基基峰峰) )，，随随后后又又失失去去COCO，，生生成成[M-43][M-43]离子：离子：2．黄酮醇类质谱 n n多数黄酮醇苷元，分子离子峰是基峰，在裂解时主要按途径-Ⅱ进行，得到B2+离子，继续失去CO形成的[B2-28]+.离子与途径Ⅱ相比，途径I通常不太主要其中，[A+H]+是来自A-环的主要离子，其上转移的H来自3-OR基团 n n在在黄黄酮酮醇醇全全甲甲基基化化衍衍生生物物的的质质谱谱图图上上，，B2+B2+离离子子应应当当出出现现在在m/z105(Bm/z105(B环环无无羟羟基基取取代代) )，，或或135(-135(-OCH3OCH3，，示示B B环环有有一一个个羟羟基基) )，，或或165(165(有有两两个个- -OCH3OCH3，，示示B B环环有有两两个个羟羟基基) )或或195(195(有有三三个个- -OCH3OCH3，，示示B B环环有有三三个个羟羟基基) )等等处处，，其中最强的峰即为其中最强的峰即为B2+B2+离子。

离子n n具有2'-OH或2'-OCH3的黄酮醇类在裂解时有个重要特点，即可以通过失去OH·或  OCH3·，形成一个新的稳定的五元杂环(二)黄酮苷类化合物的FD-MSn n黄酮苷类化合物在EI-MS上既不显示分子离子峰，也不显示糖基的碎片，故不宜用  EI-MS测定    而FD-MS谱可给出强烈的M+及[M+H]+还给出葡萄糖基的某些碎片，为化合物的结构鉴定提供了重要的信息n n在FD-MS中，因为(M+23Na)离子的强度随着溶剂极性及发射丝电流强度的改变而变化，可用以帮助区别分子离子峰(M)+及伪分子离子峰[M+1]+小结：小结：   第一节第一节   概述包括（黄酮类化合物的结构分类、生概述包括（黄酮类化合物的结构分类、生物活性）物活性）   掌握黄酮类化合物的的定义、基本结掌握黄酮类化合物的的定义、基本结构、分类和代表化合物构、分类和代表化合物第二节第二节   理化性质和显色反应理化性质和显色反应n n掌握黄酮类化合物的颜色、旋光性、溶解度的掌握黄酮类化合物的颜色、旋光性、溶解度的特性及与结构之间的关系，掌握黄酮类化合物特性及与结构之间的关系，掌握黄酮类化合物的酸碱性，酸性强弱与结构之间的关系及在提的酸碱性，酸性强弱与结构之间的关系及在提取分离中的应用，掌握显色反应与结构之间的取分离中的应用，掌握显色反应与结构之间的关系及应用。

关系及应用第三节 提取分离n n掌握黄酮类化合物的一般提取方法、PH梯度分离法与结构之间的关系，掌握黄酮类化合物聚酰胺柱层析法、硅胶柱层析法和凝胶过滤法的原理以及它们与结构之间的关系第四节 结构鉴定 n n掌握黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、查耳酮和橙酮的母核紫外光谱特征，掌握加入各种诊断试剂的黄酮类化合物的解析规律、熟悉黄酮类化合物检识的色谱方法掌握黄酮类化合物氢谱、碳谱的基本特征及其在结构鉴定中的应用，熟悉黄酮类化合物质谱的基本特点。