贝类毒素的测定 生物法1. 一、麻痹性贝类毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning n nPSPPSP中毒是最常见的食用贝类中毒中毒是最常见的食用贝类中毒n nPSPPSP由由一一组组石石房房蛤蛤毒毒及及其其衍衍生生物物组组成成，，PSPPSP与与涡涡鞭毛藻的水华有关（＞鞭毛藻的水华有关（＞10106 6个细胞／升）个细胞／升）n nPSPPSP在世界范围内分布在世界范围内分布 n nPSPPSP中中毒毒引引起起神神经经系系统统紊紊乱乱，，呼呼吸吸困困难难，，感感觉觉窒息，心肺衰竭而在窒息，心肺衰竭而在2—242—24小时内死亡小时内死亡n n一一般般PSPPSP中中毒毒在在0.5-2h0.5-2h的的时时间间内内，，症症状状逐逐渐渐发发展，能承受展，能承受12h12h以上的中毒者一般能康复以上的中毒者一般能康复 2. 麻痹性贝类毒素的测定方法n n国国际际上上麻麻痹痹性性贝贝类类毒毒素素的的检检测测方方法法较较多多，，主主要要有有小小白白鼠鼠法法、、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等。
n n生生物物法法( (即即小小白白鼠鼠法法) )是是国国际际惯惯用用的的麻麻痹痹性性贝贝类类毒毒素素的的测测定定方方法法，，已已被被美美国国公公职职分分析析化化学学家家协协会会《《公公定定分分析析方方法法》》（（AOAOAOAO）收入，而成为最普遍应用的检验方法收入，而成为最普遍应用的检验方法n n生生物物法法( (即即小小白白鼠鼠法法) )，，系系采采用用ICRICR系系列列的的小小白白鼠鼠作作为为检检验验动物，进行贝类毒素分析动物，进行贝类毒素分析n n生生物物法法( (即即小小白白鼠鼠法法) )优优势势：：当当使使用用生生物物法法检检测测法法时时，，一一旦旦发发现现超超标标样样品品，，则则本本批批样样品品不不得得食食用用，，这这说说明明所所检检测测贝贝类类中中相相关关的的毒毒素素含含量量已已经经影影响响到到人人们们的的食食用用安安全全，，不不适适合合食食用3. 麻痹性贝类毒素的测定 生物法 (SC/T 3023-2003)原理n n根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出根据小鼠注射贝类提取液后的死亡时间，查出鼠单位，计算确定每鼠单位，计算确定每100g100g贝肉中贝肉中PSPPSP的含量的含量n n特点：特点：测定结果代表存在于贝肉内各种化学结测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的麻痹性贝类毒素的总量构的麻痹性贝类毒素的总量n n鼠单位鼠单位 mouse unit mouse unit，，MUMU：对体重为：对体重为20g20g的小白的小白鼠腹腔注射鼠腹腔注射1mL1mL麻痹性贝类毒素后，小鼠在麻痹性贝类毒素后，小鼠在15min15min时死亡所需的最低毒素量时死亡所需的最低毒素量 4. 试剂n n盐酸溶液：0.1 mol/Ln n盐酸溶液：5 mol/Ln n氢氧化钠溶液：0.1 mol/L5. 仪器和设备n n均质器均质器n n天平（感量天平（感量0.1g0.1g））n n离心机离心机n npHpH计计n n秒表秒表n n玻璃皿；烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等玻璃皿；烧杯、量筒、容量瓶、搅拌棒等n n注射器：注射器：1mL1mLn n注射器针头：注射器针头：8 8# #6. 小白鼠：n n 体重为19-21g的健康ICR系雄性小白鼠n n 若体重＜19g或＞21g，查表中的校正系数便可得到校正的死亡时间n n 体重＞23g、或已用过的小白鼠则不能使用 7. 样品的测定检样的制备n n贝类贝类 洗洗净净外外壳壳，，切切断断闭闭壳壳肌肌，，开开壳壳，，用用清清水水淋淋洗洗内内部部去去除除泥泥沙沙及及其其他他外外来来杂杂质质，，仔仔细细取取贝贝 肉肉 ，， 收收 集集 沥沥 水水5min5min（（避避免免贝贝肉肉堆堆积积）），，捡捡出出碎碎壳壳等等杂杂物物，，将贝肉均质将贝肉均质 n n注注意意：：取取肉肉时时切切勿勿割割破破肉肉体体，，开开壳壳前前不不能能加加热热或或用用麻麻醉醉剂剂8. 样品的测定检样的制备n n贝类罐头贝类罐头1.1.将将罐罐内内所所有有内内容容物物（（包包括括贝贝肉肉组组织织及及汁汁液液）），，于均质器中均质于均质器中均质2.2.大大容容量量的的罐罐头头，，则则过过滤滤分分离离贝贝肉肉及及汁汁液液，，分分别别称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质称重，将固形物和汤汁按比例混合，充分均质n n冷冻贝类冷冻贝类 在在室室温温下下，，使使冷冷冻冻的的样样品品（（带带壳壳或或脱脱壳壳的的））呈呈半半冷冷冻冻状状态态，，按按上上述述规规定定的的方方法法清清洗洗、、开开壳壳、、淋洗、取肉、均质淋洗、取肉、均质9. 样品的测定提取n n取取 100g100g样样 品品 于于 800mL800mL烧烧 杯杯 中中 ，， 加加0.1mol/L 0.1mol/L HClHCl溶溶液液100mL100mL充充分分搅搅拌拌，，检检查查pHpH（（pHpH应应为为2.0-4.02.0-4.0））。
需需要要时时，，可可逐逐滴滴加加入入5mol/L 5mol/L HClHCl溶溶液液或或0.1mol/L 0.1mol/L NaOHNaOH溶溶液液调调整整pHpH，，加加碱碱时时速速度度要要慢慢，，同同时时需需不不断断搅搅拌拌，，防防止局部碱化破坏毒素止局部碱化破坏毒素n n将将混混合合物物加加热热，，并并徐徐徐徐煮煮沸沸5min5min，，冷冷却却至至室室温温，，调调节节pHpH至至2.0-4.02.0-4.0（（切切勿勿＞＞4.54.5））将将混混合合物物移移至至量筒中并稀释至量筒中并稀释至200mL200mL10. 样品的测定提取n n将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至将混合物倒回烧杯，搅拌至均质状，使其沉降至上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可上清液呈半透明状，不能堵塞注射针头即可n n必要时将混合物或上清液以必要时将混合物或上清液以3000r/min3000r/min离心离心5min5min，，或用滤纸过滤或用滤纸过滤n n保留进行小鼠注射用的足量液体（约保留进行小鼠注射用的足量液体（约10mL10mL））11. 样品的测定小鼠试验n n选择选择ICRICR系小鼠系小鼠n n称称重重：：以以感感量量为为0.1g0.1g的的天天平平将将小小鼠鼠称称重重并并记录重量记录重量12. 样品的测定小鼠试验n n每每个个样样品品注注射射3 3只只小小鼠鼠，，每每只只小小鼠鼠腹腹腔腔注注射射1mL1mL提提取取液液。
注注射射时时若若有有一一滴滴以以上上提提取取液液溢溢出出，，须须将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠将该只小鼠丢弃，并重新注射一只小鼠n n记录注射完毕时间，仔细观察记录注射完毕时间，仔细观察 并用秒表记录小鼠停止呼吸时并用秒表记录小鼠停止呼吸时 的死亡时间（到小鼠呼出最的死亡时间（到小鼠呼出最 后一口气止）后一口气止）13. 样品的测定小鼠试验n n若若注注射射样样品品原原液液后后，，1 1只只或或2 2只只小小鼠鼠的的死死亡亡时时间间大大于于7min7min，，则则需需再再注注射射至至少少3 3只只小小鼠鼠以以确确定定样样品的毒力品的毒力n n若小鼠的死亡时间小于若小鼠的死亡时间小于5min5min，则要稀释样品提，则要稀释样品提取液后，再注射另一组小鼠（取液后，再注射另一组小鼠（3 3只），得到只），得到5min-7min5min-7min的死亡时间的死亡时间n n稀释提取液时，要调节稀释提取液时，要调节pHpH至至2.0-4.0,2.0-4.0,逐滴加入逐滴加入0.1mol/L0.1mol/L或或0.01mol/LHCl0.01mol/LHCl溶液溶液14. 结果的计算与判断毒力的计算毒力的计算n n根根据据小小鼠鼠的的死死亡亡时时间间，，在在附附录录B B 中中查查出出相相应应的的每每毫毫升升注注射射液的鼠单位数液的鼠单位数M Mn n 将存活鼠的死亡时间视为大于将存活鼠的死亡时间视为大于60min60min即相当于＜即相当于＜0.875MU0.875MUn n若若试试验验动动物物重重量量＜＜19g19g或或＞＞21g21g。
则则根根据据附附录录C C查查出出重重量量校校正系数正系数k kn n样品中样品中PSPPSP的含量按公式（的含量按公式（1 1）计算…………………………（（1 1）） 式中：式中： X X——样品中样品中PSPPSP含量，每百克样品中鼠单位（含量，每百克样品中鼠单位（MU / 100gMU / 100g）） K Ki i——每只小鼠的重量校正系数每只小鼠的重量校正系数 M Mi i——每只小鼠的鼠单位数，鼠单位（每只小鼠的鼠单位数，鼠单位（MUMU）） D D——样品提取液的稀释倍数样品提取液的稀释倍数 200— 200—样品量，克（样品量，克（g g））15. 16. 17. 结果的计算与判断毒力单位转换样品中的毒力单位的按公式（样品中的毒力单位的按公式（4 4）计算F·80µg /100gF·80µg /100g＝＝400MU/100g ………400MU/100g ………（（3 3）） F=5 F=5式中：式中： F— F—毒素转换系数；毒素转换系数； 80µg /100g— 80µg /100g—样品中样品中PSPPSP限量，限量，µg /100gµg /100g 400MU/100g— 400MU/100g—样品中样品中PSPPSP限量，限量，MU/100gMU/100g 18. 二、腹泻性贝类毒素（DSP）Diarrhetic shellfish poisoningn nDSPDSP是由于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起是由于双壳贝类滤食含毒的涡鞭毛藻而引起n n影影响响较较严严重重的的地地区区主主要要是是日日本本和和欧欧洲洲沿沿海海国国家家，，发病率高，引起许多国家地区的关注发病率高，引起许多国家地区的关注n n受受DSPDSP中中毒毒的的症症状状表表现现为为消消化化功功能能紊紊乱乱（（腹腹泻泻、、呕呕吐吐、、腹腹痛痛）），，食食用用含含毒毒贝贝类类后后3030分分钟钟至至几几小小时时出出现现症症状状，，中中毒毒者者一一般般在在3-43-4天天康康复复，，尚尚无无死死亡病例亡病例19. 腹泻性贝类毒素的测定方法n n在国际上对腹泻性贝类毒素的检测方法较多，主要有生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、放射性免疫法等n n生物法（小白鼠法，Mouse bioassay）是最常用的一种方法20. 腹泻性贝类毒素的测定 生物法(SC/T 3024-2004)原理原理n n用用丙丙酮酮提提取取贝贝类类中中毒毒素素，，再再转转移移至至乙乙醚醚中中，，经经减减压压浓浓缩缩蒸蒸干干后后，，再再以以1%1%吐吐温温－－6060生生理理盐盐水水溶溶解解残残留留物物，，注注射小白鼠观察存活情况，计算其毒力射小白鼠观察存活情况，计算其毒力试剂和材料试剂和材料n n丙酮（分析纯）丙酮（分析纯）n n乙醚（分析纯）乙醚（分析纯）n n1%1%吐吐温温-60-60生生理理盐盐水水：：称称取取1.0g1.0g吐吐温温-60-60，，溶溶于于生生理理盐盐水（水（0.8%NaCl0.8%NaCl）中，并定容至）中，并定容至100.0mL100.0mL21. 仪器和设备n n旋转蒸发器旋转蒸发器n n均质器均质器n n磨口烧瓶：圆底，磨口烧瓶：圆底，500 mL500 mL，，250 mL250 mL，，100 mL100 mLn n布氏漏斗：布氏漏斗：φ100mmφ100mmn n分液漏斗：具塞，分液漏斗：具塞，500 mL500 mLn n天平：感量天平：感量0.1g0.1gn n刻度试管：刻度试管：10mL10mL，具塞，具塞n n冰箱：冰箱：0℃-5℃0℃-5℃和和-15℃- -20℃-15℃- -20℃n n注射器：注射器：1mL1mLn n注射器针头：注射器针头：8 8# #n n小白鼠：体重为小白鼠：体重为16-20g16-20g的健康的健康ICRICR系雄性小白鼠系雄性小白鼠 22. 检样的制备生鲜带壳的贝类生鲜带壳的贝类n n用用清清水水彻彻底底洗洗净净贝贝类类外外壳壳，，开开壳壳，，用用清清水水淋淋洗洗内内部部去去除除泥泥沙沙及及其其他他外外来来杂杂质质，，仔仔细细取取出出贝贝肉肉，，切切勿勿割割破破肉肉体体n n收收集集贝贝肉肉，，沥沥水水5min5min，，捡捡出出碎碎壳壳等等杂杂物物，，迅迅速速冷冷冻冻，，贮藏备用贮藏备用n n注注意意不不要要破破坏坏闭闭壳壳肌肌以以外外的的组组织织，，尤尤其其是是中中肠肠腺腺（（又又称称消消化化盲盲囊囊，，组组织织呈呈暗暗绿绿色色或或褐褐绿绿色色））。
开开壳壳前前不不能能加热或用麻醉剂加热或用麻醉剂冷冻贝类冷冻贝类n n在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻在室温下，使冷冻的样品（带壳或去壳的）呈半冷冻状态，按上述方法清洗、开壳、淋洗、取肉状态，按上述方法清洗、开壳、淋洗、取肉23. 检样的制备取 样n n可可以以切切取取中中肠肠腺腺的的贝贝类类（（扇扇贝贝、、贻贻贝贝、、牡牡蛎蛎等等）），，称称取取200g200g贝贝肉肉后后，，仔仔细细切切取取全全部部中中肠肠腺腺，，将将中中肠肠腺腺称称重重后后细细切混合做为检样，注意不要使中肠内容物污染案板切混合做为检样，注意不要使中肠内容物污染案板n n 对对于于尚尚未未确确定定部部位位毒毒性性的的贝贝类类及及不不易易切切取取中中肠肠腺腺的的小小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，做为检样型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，做为检样n n为为避避免免毒毒素素的的危危害害，，应应戴戴手手套套进进行行检检验验操操作作，，移移液液管管等等用用过过的的器器材材应应在在5%5%的的次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液中中浸浸泡泡1h1h以以上上，，以以使使毒毒素素分分解解；；废废弃弃的的提提取取液液等等也也应应用用5%5%的的次次氯氯酸酸钠钠溶溶液液处处理理24. 提取n n取取处处理理好好的的中中肠肠腺腺，，或或200g200g贝贝肉肉置置于于均均质质杯杯内内，，均质均质2min2minn n加加3 3倍倍量量丙丙酮酮，，与与样样品品充充分分搅搅拌拌均均匀匀后后，，用用布布氏氏漏漏斗斗抽抽滤滤并并收收集集提提取取液液。
对对残残渣渣以以检检样样两两倍倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液25. 提取n n将将抽抽提提液液移移入入500mL500mL的的磨磨口口烧烧瓶瓶中中，，减减压压浓浓缩缩（（旋旋转转蒸蒸发发器，器，56℃56℃）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物）去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物n n将将浓浓缩缩液液移移入入分分液液漏漏斗斗内内，，以以100mL100mL－－200mL200mL乙乙醚醚和和少少量量的的水水洗洗下下粘粘壁壁部部分分，，轻轻轻轻振振荡荡( (不不能能生生成成乳乳浊浊液液) )，，静静置置分分层层后，去除水层后，去除水层( (下层下层) )n n用用相相当当乙乙醚醚半半量量的的蒸蒸馏馏水水洗洗乙乙醚醚层层两两次次，，再再将将乙乙醚醚层层移移入入250mL250mL的的磨磨口口烧烧瓶瓶中中，，减减压压浓浓缩缩( (旋旋转转蒸蒸发发器器，，35℃)35℃)去去除除乙醚乙醚26. 提取n n以以少少量量乙乙醚醚将将浓浓缩缩物物移移入入100mL100mL磨磨口口烧烧瓶瓶中中，，再再次次减减压压浓缩去除乙醚浓缩去除乙醚n n以以1%1%吐吐温温6060生生理理盐盐水水将将全全部部浓浓缩缩物物在在刻刻度度试试管管中中稀稀释释到到10mL10mL。
此此时时1mL1mL试试液液相相当当于于20g20g去去壳壳贝贝肉肉的的重重量量，，以以此悬浮液做为试验原液此悬浮液做为试验原液27. 小白鼠试验n n振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液振荡使试液或其稀释液成为均匀的悬浮液n n将将每每只只小小白白鼠鼠称称重重，，每每三三只只小小白白鼠鼠为为一一组组，，分分别别将将1mL1mL试液注射到小白鼠腹腔中试液注射到小白鼠腹腔中n n同同时时，，另另取取三三只只小小白白鼠鼠作作为为对对照照组组，，注注射射1mL 1mL 1%1%吐吐温温- -6060生理盐水于腹腔中生理盐水于腹腔中n n观察自注射开始到观察自注射开始到24h24h后的小白鼠后的小白鼠 存活情况，求出一组三只中死亡两存活情况，求出一组三只中死亡两 只及两只以上的最小注射量只及两只以上的最小注射量n n小白鼠注射腹泻性贝毒后的症状小白鼠注射腹泻性贝毒后的症状 为运动不活泼，大多呼吸异常，为运动不活泼，大多呼吸异常， 致死时间长致死时间长28. 结果计算和表述毒力的计算n n使体重16-20g的小白鼠在24h死亡的毒力为1个小白鼠单位（MU）n n样品中DSP毒力的计算，按表1选择24h内死亡二只及二只以上白鼠的最小注射量及最大稀释倍数进行计算29. 注射量与毒力的关系 试验液试验液 注射量注射量mL mL 检样量检样量1 1））g g 毒力毒力MU/g MU/g 原液原液原液原液2 2倍稀释液倍稀释液2 2倍稀释液倍稀释液4 4倍稀释液倍稀释液4 4倍稀释液倍稀释液8 8倍稀释液倍稀释液8 8倍稀释液倍稀释液1616倍稀释液倍稀释液1616倍稀释液倍稀释液1.01.00.50.51.01.00.50.51.01.00.50.51.01.00.50.51.01.00.50.52020101010105 55 52.52.52.52.51.251.251.251.250.6250.6250.050.050.10.10.10.10.20.20.20.20.40.40.40.40.80.80.80.81.6 1.6 1 1）以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳贝肉量。
以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳贝肉量 30. 谢谢 ！31. 。