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1、DNA甲基化甲基化1DNA甲基化甲基化 基本原理基本原理DNA甲基化作为DNA序列的修饰方式，是一种重要的表观遗传机制，能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，在生命活动中起着重要的作用。在DNA甲基转移酶(Dnmt)的催化下，以S一腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到DNA分子中特定碱基上的过程，最常见的是在胞嘧啶上形成5 甲基胞嘧啶。23DNA甲基化和CpG IslandsDNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。CpG岛岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区，是鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，只有CpG岛的胞嘧啶能
2、够被甲基化。 CpG岛中的岛中的CpG位点通常是位点通常是处于非甲基化状态，而在处于非甲基化状态，而在CpG岛外的岛外的CpG位点则通位点则通常是甲基化的。常是甲基化的。近来研究发现DNA甲基化还发生在基因转录起始点上游2 kb左右称为“CpG岛岸”（CpG island shore）的区域，绝大部分组织特异性的绝大部分组织特异性的DNA甲基甲基化发生在化发生在“CpG岛岸岛岸”而非而非“CpG岛岛”区域。区域。 45DNA甲基化与基因印记甲基化与基因印记基因印迹基因印迹指在配子或合子发生期间，来自亲本的等位基因或染色体在发育过程中产生专一性的加工修饰专一性的加工修饰，从而导致后代体细导致后代
3、体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达活性。达活性。基因组印迹的分子机理与印迹基因中胞嘧啶甲基化尤其是CpG岛的甲基化岛的甲基化密切相关。若基因印迹作用丧失，本应处于本应处于“关闭关闭”状态的基因被错误激活开启状态的基因被错误激活开启，导致疾病。6DNA甲基化表观遗传机制甲基化表观遗传机制基因启动子区内CpG位点的甲基化可能通过3种种方式影响该基因转录活性：DNA序列甲基化直接阻碍转录因子的结合甲基CpG结合蛋白(MBPs)结合到甲基化CpG位点，与其他转录复合抑制因子相互作用或招募组蛋白修饰酶改变染色质结构染色质结构的凝集阻碍转录因子与其调控序列的结合
4、。7直接阻碍转录因子的结合直接阻碍转录因子的结合Ap-2、c-myc、myn、细胞AMP依赖活性因子CREB、E2F、 NF-KB ，所识别序列都含有CpG残基，这些部位一旦被甲基化，转录因子便不能再与此部位结合。8甲基甲基CpG结合蛋白与转录抑制结合蛋白与转录抑制MBPs能特异性结合甲基化CpG位点。MBPs包括MBD(methyl-CpG-binding domain)家族，MBD家族包括MBDl、MBD2、MBD3与MBD4。MBDs往往以蛋白复合体的形式发挥作用。抑制因子MeCP1(methyl cytosine binding protein1)与MeCP2_2 可以结合一些甲基化C
5、pG残基。MeCP1可结合含有多重对称性甲 基化CpG位点的DNA，不结合半甲基化CpG位点。9DNA甲基化通过改变染色质结构甲基化通过改变染色质结构抑制转录抑制转录现DNA序列的甲基化能够指导核心组蛋白H3H4的修饰以及连接组蛋白H1之间的连接作用，组蛋白组蛋白H3与与H4氨基端结构域中多个氨基端结构域中多个赖氨酸残基被乙酰化后，将会降低整个核赖氨酸残基被乙酰化后，将会降低整个核小体对小体对DNA的亲和力，还可以阻止或降低的亲和力，还可以阻止或降低与转录或其调节有关蛋白质的相互作用。与转录或其调节有关蛋白质的相互作用。 因此，甲基化可以通过染色质结构的改变阻断转录因子的通路使其处于稳定失活状
6、态。10DNA甲基化参与肿瘤的机制甲基化参与肿瘤的机制当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。11DNA甲基化与肺癌的早期诊断甲基化与肺癌的早期诊断于DNA甲基化出现在几乎所有肿瘤中，并且发生在癌前病变和癌变早期癌前病变和癌变早期，因此是肿瘤早期诊断的理想标志物。DNA甲基化改变常发生于肿瘤形成过程，包括全基因组水平全基因组水平DNA低甲基化和低甲基化和CpG岛岛高甲基化。高甲基化。抑癌基因的失活抑癌基因的失活是肿瘤发生的重要分子基础。12Tumorsuppressorgenescor
7、relatedwithNSCLC1.p16基因基因位于人第9条染色体p21区，参与细胞周期蛋白调控，通过与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4及CDK6结合而抑制后者活性，进而抑制细胞增殖，是一种重要的抑癌基因。p16启动子区5-CpG岛甲基化是其失活的重要原因，在肺癌发生发展中起重要作用。13TumorsuppressorgenescorrelatedwithNSCLC2.RASSF1ARas相关区域家族1A（RASSF1A）是人类肿瘤中甲基化频率最高的一个抑癌基因，RASSF1A主要参与细胞周期的调节，该基因甲基化与肺癌发生发展及预后关系密切。14Tumorsuppressorgenescorre
8、latedwithNSCLC3. CDH1、CDH13CDH1、CDH13基因均属于钙粘蛋白家族。CDH1编码的蛋白E-cadherin是一跨膜糖蛋白，在肿瘤侵袭转移肿瘤侵袭转移方面起重要作用，是公认的浸润转移抑制基因浸润转移抑制基因。该基因启动子区CpG岛甲基化是E-cadherin失活的重要机制。CDH13基因编码蛋白H-cadherin，起着抑癌基因作用，启动子区CpG岛甲基化是H-cadherin失活的重要机制。15Tumor suppressor genes correlated with NSCLC4. DAPK死亡相关蛋白激酶DAPK基因作为抑癌基因具有调节凋亡的功能，与肺癌的发
9、生发展密切相关，其因启动子甲基化而表达缺失可导致多种肿瘤发生。16TumorsuppressorgenescorrelatedwithNSCLC5.MGMTO6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）是一种高效修复酶，能修复DNA序列中6-氧-甲基鸟嘌呤损伤，对维持基因组的稳定性有重要意义，该基因的表达缺失该基因的表达缺失可以导致肺癌的发生发展，其启动子区甲可以导致肺癌的发生发展，其启动子区甲基化是基化是MGMT去表达的重要机制。去表达的重要机制。17Tumorsuppressorgenescorrelated
10、withNSCLC与非小细胞肺癌相关的甲基化基因还有：与非小细胞肺癌相关的甲基化基因还有：FHIT、HIC-1、AKAPl2、ESRl、CYGB、OPCML、 ADAMTSl、TGFBI、RUNX3、UMDl、hSRBC、CADM1、p14ARF、p16INK4a、DAPK、GSTP1、MGMT、MLH1、FBN2、DAL-1、ASC等。18DNA甲基化与肺癌的早期诊断甲基化与肺癌的早期诊断DNA甲基化作为肺癌早期诊断的分子标志物，其敏感性敏感性和特异性特异性是研究关注的焦点。目前尚未发现敏感性和特异性非常高的DNA甲基化标志物。19检测标本检测标本1.血液中血液中DNA甲基化的检测甲基化的检
11、测 外周血是肺癌早期筛查和诊断比较理想的样本，肿瘤患者血液中存在肿瘤细胞释放的高水平的循环DNA，并且与原发肿瘤有着相同的基因改变。2.痰液中痰液中DNA甲基化的检测甲基化的检测 痰液含有来自肺和下呼吸道的脱落细胞，具有一定的特异性。20检测标本检测标本3.支气管灌洗液中支气管灌洗液中DNA甲基化的检测甲基化的检测 同痰液类似，支气管灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）来源于肺的特定肺叶，可能含有肺癌细胞或者DNA可用于肺癌早期诊断。4. 呼出气冷凝液中呼出气冷凝液中DNA甲基化的检测甲基化的检测 呼出气冷凝液（exhaled breath condensate,
12、EBC）中除了大部分水蒸气外，还含有脂质、蛋白质和DNA等，在诊断哮喘、慢性阻塞性肺病等肺疾病中已初步体现出应用价值。可用于肺癌的诊断。 21DNA甲基化与肺癌的治疗甲基化与肺癌的治疗由于DNA甲基化是靠DNMT来维持的，在CpG甲基化异常机制参与的肿瘤细胞中常表现为过度表达。因此，DNMT成为DNA去甲基化、恢复抑癌基因功能的热点靶向分子。目前去甲基化药物主要是指DNMT抑制刺，它通过抑制DNMT来恢复抑癌基因的功能，从而达到治疗肿瘤的目的。22DNA去甲基化途径去甲基化途径1） 被动途径被动途径： 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNM
13、T1 的作用。 2） 主动途径主动途径： 是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。23去甲基化药物机理去甲基化药物机理去甲基化药物通过抑制抑制DNMT的活性的活性使复制后的DNA不能再次甲基化，这就导致所有等位基因表现为去甲基化，从而使抑癌基因得以恢复表达、抑制肿瘤的生长，在细胞生理学上的改变主要包括诱导细胞分化、细胞分化、弱亡、衰老和免疫应答弱亡、衰老和免疫应答。24去甲基化药物机理示意图去甲基化药物机理示意图EGCG on DNMT1 inhibition25DNA甲基化研究的展望甲基化研究的展望1. 癌症早期患者的血样具有极高的研究价值。2.在样品中寻找敏感性敏感性和特异性特异性高的DNA甲基化标志物以作为肺癌早期诊断的有力工具。3.深入研究深入研究DNA去甲基化机制，在癌前病去甲基化机制，在癌前病变患者血样中寻找较高特异性变患者血样中寻找较高特异性DNA甲基化甲基化位点的同时探寻抑制此位点高度甲基化的位点的同时探寻抑制此位点高度甲基化的方法方法。26THEENDTHEENDTHANKYOUTHANKYOU27
