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1、 基因工程药物基因工程药物促红细胞生成素促红细胞生成素（EPO）EPO的的概念概念EPO的的用途用途及其及其疗效疗效EPO的的纯化历纯化历史史及及工艺流程工艺流程EPO的的销售情销售情情况情况及其及其前景前景什么是EPO？EPO：是促红细胞生成素（：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英）的英文简称。文简称。 促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促
2、进红细胞生成。它与泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应结合后共同介导缺氧的生理反应。EPO的用途的用途医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。体育用途体育用途(兴奋剂兴奋剂)：增加训练耐力和训练负：增加训练耐力和训练负荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在荷，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。年北京奥运会中第一例的兴奋剂。EPO的的 疗效疗效1、肾性贫血患者、肾性贫血患者EPO水平较低
3、，在进行治疗过程水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射中，往往通过注射EPO来提高体内来提高体内EPO水平进行治水平进行治疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时疗，从而帮助病人增加红细胞数量，此时EPO水平水平有所上升。有所上升。2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓治疗，此时浓度也会有所升高。度也会有所升高。3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。水平升高。EPO的纯化历史的纯化历史1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对
4、设备及操的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。作要求也较高，不适合工业生产的特点。2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。3、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程、近年来则利用三步层析法三步纯化基本流程 等。等。EPO的工艺流程的工艺流程三步层析法三步层析法1、 染料配基亲和层析染料配基亲和层析反相疏水层析反相疏水层析离离子交换层析子交换层析;2、
5、染料配基亲和层析染料配基亲和层析反相疏水层析反相疏水层析分分子筛层析子筛层析;3、 反相疏水层析反相疏水层析离子交换层析离子交换层析分子筛分子筛层析。层析。EPO的工艺流程的工艺流程三步纯化基本流程三步纯化基本流程第一步：反相柱色谱第一步：反相柱色谱 样品浓缩约样品浓缩约样品浓缩约样品浓缩约96.7%96.7%透析透析第二步：第二步： DEAE-离子交换色谱离子交换色谱第三步：第三步： 分子筛色谱分子筛色谱 总回收率总回收率总回收率总回收率 30%30% 比活比活比活比活 1.5*101.5*108 8U/gU/g蛋白蛋白蛋白蛋白第一步：反相色谱第一步：反相色谱vvC6 反相柱（反相柱（2cm
6、*2cm） （创新生物技术（创新生物技术公司）公司）vv流程：流程： 上样上样上样上样 50ml/min 50ml/min（柱结合量约（柱结合量约（柱结合量约（柱结合量约5mg5mg蛋白蛋白蛋白蛋白/ml/ml介质介质介质介质) ) 去离子水去离子水去离子水去离子水平衡至检测基线平衡至检测基线平衡至检测基线平衡至检测基线 10%80%10%80%乙醇胍乙醇胍乙醇胍乙醇胍线性梯度洗脱线性梯度洗脱线性梯度洗脱线性梯度洗脱 检测并收集含检测并收集含检测并收集含检测并收集含EPOEPO主峰主峰主峰主峰 ELISA ELISA测定测定测定测定vv结果：结果：60%60%乙醇乙醇乙醇乙醇-1mol/L-1
7、mol/L盐酸胍盐酸胍盐酸胍盐酸胍洗出洗出EPO透析透析vv透析液：透析液：10倍体积的倍体积的10mmol/L Tris.HCl (pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液蔗糖缓冲液vv透析次数：透析次数：2vv时间：时间：56h第二步：离子交换柱第二步：离子交换柱vvDEAE型离子交换柱型离子交换柱vv流程：流程： 10mmol/L 10mmol/L Tris.HClTris.HCl(pH7.5)(pH7.5)缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液平平平平 上样上样上样上样 20ml/min 20ml/min（柱结合量（柱结合量（柱结合量（柱结合量20mg/ml20mg/ml） 10mmol/L Tris.HCl
8、(pH7.5) 10mmol/L Tris.HCl(pH7.5)缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡缓冲液平衡至基线至基线至基线至基线 添加添加添加添加NaClNaCl入缓冲液，进行入缓冲液，进行入缓冲液，进行入缓冲液，进行截状梯度洗脱截状梯度洗脱截状梯度洗脱截状梯度洗脱（NaClNaCl浓浓浓浓度分别为：度分别为：度分别为：度分别为：5050，7070，125mmol/L125mmol/L）vv结果：结果： ELISA检测盒表明检测盒表明75mmol/L洗脱峰洗脱峰中含中含EPO第三步：分子筛色谱第三步：分子筛色谱vvSephacryl S-200 色谱分析色谱分析vv流程：流程： 上样体积上样体
9、积上样体积上样体积 80ml 80ml 流速流速流速流速 2ml/min 2ml/min 流动相流动相流动相流动相 20mmol/L 20mmol/L 柠檬酸钠柠檬酸钠柠檬酸钠柠檬酸钠- 100mmol/L NaCl - 100mmol/L NaCl 缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液vv结果：结果：收集的收集的收集的收集的rHuEPOrHuEPO保留时间约为保留时间约为保留时间约为保留时间约为45min 45min 比活性约为比活性约为比活性约为比活性约为1.5*101.5*108 8U/gU/g蛋白；纯度蛋白；纯度蛋白；纯度蛋白；纯度 98%98%（SDS-SDS-PAGEPAGE检测）检测）检测）
10、检测） 免疫原性检测：免疫原性检测：免疫原性检测：免疫原性检测：Western blotWestern blotEPO的销售情况的销售情况重组促红细胞生成素，也称超级重组促红细胞生成素，也称超级“重磅炸弹重磅炸弹”基因基因药物药物 。1985年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重年科学家应用基因重组技术，在实验室获得重组人组人EPO（rhEPO），），1989年安进（年安进（Amgen）公）公司的第一个基因重组药物司的第一个基因重组药物Epogen获得获得FDA的批准，的批准，适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或适应症为慢性肾功能衰竭导致的贫血、恶性肿瘤或化疗导致的贫血、失血后贫血等
11、，其市场表现不俗，化疗导致的贫血、失血后贫血等，其市场表现不俗，1999年销售值达到年销售值达到17.6亿美元，亿美元，2000年年19.6亿美元，亿美元，2002年年22.6亿美元，亿美元，2003年年24.4亿美元，成为名副亿美元，成为名副其实的其实的“重磅炸弹重磅炸弹”基因药物。基因药物。 安进（安进（Amgen）开发的用于治疗恶性贫血症的第二）开发的用于治疗恶性贫血症的第二代促红细胞生成素新产品代促红细胞生成素新产品Arnesp2001年得到年得到FDA的批准，的批准，Arnesp2002年初正式上市。年初正式上市。Arnesp：是一种：是一种“高糖基化高糖基化”促红素产品。其促进促红
12、素产品。其促进红细胞生成的能力大大优于第一代红细胞生成的能力大大优于第一代EPO（促红细胞（促红细胞生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们生成素）产品。第一年上市即大获全胜，赢得开们红，红，Arnesp2002年全年销售额为年全年销售额为4.2亿美元，亿美元，2003年全年销售额为年全年销售额为15.4亿美元。亿美元。估计在今后估计在今后3年内，年内，Arnesp将创造将创造10亿亿15亿美元亿美元的市场销售额并夺取现有的市场销售额并夺取现有EPO生产商的部分市场，生产商的部分市场，其市场前景不可估量。其市场前景不可估量。2001年，年，EPO（包括（包括Arnesp）的全球销售额达）的
13、全球销售额达21.1亿美元，亿美元，2002年达年达26.8亿美元，亿美元，2003年全世界年全世界EPO的年销售额超过的年销售额超过50亿美元。创下生物工程药品亿美元。创下生物工程药品单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。单个品种之最，是当今最成功的基因工程药物。 强生（强生（Johnson&Johnson）公司的促红细胞生成）公司的促红细胞生成素素Procrit/Eprex更是表现不俗，更是表现不俗，2001年销售额年销售额34.42亿美元，亿美元，2002年销售额年销售额42.69亿美元，亿美元， 2003年销售收入达到年销售收入达到39.84亿美元。亿美元。 目前，国内已有目前，国
14、内已有10多家单位获准生产红细胞多家单位获准生产红细胞生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生成素。沈阳三生和上海麒麟鲲鹏（中国）生物药业的产品在国内医院的销售额独领风生物药业的产品在国内医院的销售额独领风骚，骚，2001年年EPO的国内医院销售总额约为的国内医院销售总额约为47449万元，万元，2002年为年为49508万元，万元，2003年年上半年为上半年为28606万元。万元。估计国内的年市场容量在估计国内的年市场容量在20到到30亿元左右，亿元左右，但目前年销售额只有区区但目前年销售额只有区区5亿元左右。亿元左右。综上所述，综上所述，EPO的市场前景非常可观的市场前景非常可观。 EPO的市场前景的市场前景
