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1、第十一章第十一章 中药分析概论中药分析概论 Analysis of traditional Chinese medicines药物分析学药物分析学 总论总论目 录中药分析的特点中药分析的特点中药分析的特点中药分析的特点12鉴别实验鉴别实验鉴别实验鉴别实验3检查检查检查检查4含量测定含量测定含量测定含量测定5中药安全性相关的质量控制项目中药安全性相关的质量控制项目中药安全性相关的质量控制项目中药安全性相关的质量控制项目6中药指纹图谱和特征图谱中药指纹图谱和特征图谱中药指纹图谱和特征图谱中药指纹图谱和特征图谱7中药分析的样品处理方法中药分析的样品处理方法中药分析的样品处理方法中药分析的样品处理方法
2、中药体内分析中药体内分析中药体内分析中药体内分析8 Traditional Chinese Medicine / herbal medicine 以中医药学理论体系的术语表述其以中医药学理论体系的术语表述其性能、功效和使用规律，并且按中医性能、功效和使用规律，并且按中医药学理论指导其临床应用的传统药物。药学理论指导其临床应用的传统药物。中药中国药典中国药典20102010年版年版I I部部药材和饮片药材和饮片植物油脂和提取物植物油脂和提取物成方制剂和单味制剂成方制剂和单味制剂 中药中药分析的特点中药分析的特点v以中医药理论为指导以中医药理论为指导以中医药理论为指导以中医药理论为指导，评价中药质
3、量的整体性，评价中药质量的整体性，评价中药质量的整体性，评价中药质量的整体性 v化学成分的多样性和复杂性化学成分的多样性和复杂性化学成分的多样性和复杂性化学成分的多样性和复杂性 v药效成分的非单一性药效成分的非单一性药效成分的非单一性药效成分的非单一性 v原药材质量的差异性原药材质量的差异性原药材质量的差异性原药材质量的差异性 v工艺、炮制方法及辅料的特殊性工艺、炮制方法及辅料的特殊性工艺、炮制方法及辅料的特殊性工艺、炮制方法及辅料的特殊性 v杂质来源的多途经性杂质来源的多途经性杂质来源的多途经性杂质来源的多途经性 v质量控制方法的多源性质量控制方法的多源性质量控制方法的多源性质量控制方法的多
4、源性 五倍子五倍子 鞣质（鞣质（70%）槐米槐米 芦丁（芦丁（20%）长春花长春花 长春新碱（百万分之一）长春新碱（百万分之一）2 2、各种有效成分含量相差悬殊、各种有效成分含量相差悬殊1 1、成分复杂且多数有效成分尚不十分清楚、成分复杂且多数有效成分尚不十分清楚中药分析的特点7原因：生长环境、采收季节及部位差异原因：生长环境、采收季节及部位差异不同产地不同产地金银花：绿原酸；山东平邑所产为金银花：绿原酸；山东平邑所产为5.66%5.66%，山，山西大谷为西大谷为3.88%3.88%，云南大理为，云南大理为1.81%1.81%采收季节采收季节丹参：丹参酮丹参：丹参酮 1111、1212月份含量
5、最高月份含量最高3、中药材质量的不稳定性、中药材质量的不稳定性 例：三黄泻心汤干浸膏例：三黄泻心汤干浸膏 常压常压 减压减压 逆浸透逆浸透 成分成分 浓缩浓缩 浓缩浓缩 喷雾喷雾大黄酸葡萄糖苷大黄酸葡萄糖苷 41.1 51.6 98.6%小檗碱小檗碱 34.5 37.5 94.5%黄连碱黄连碱 6.3 12.0 93.7%黄芩苷黄芩苷 77.4 77.6 98.5%4 4、制剂工艺不同，有效成分含量也不同、制剂工艺不同，有效成分含量也不同针对不同的剂型，采用相应的方法进行分针对不同的剂型，采用相应的方法进行分离纯化后测定离纯化后测定蜜丸蜜丸 蜂蜜蜂蜜锭剂锭剂 糯米粉、黄米粉糯米粉、黄米粉胶剂胶
6、剂 豆油、黄酒、冰糖豆油、黄酒、冰糖5 5、剂型繁多，辅料干扰大、剂型繁多，辅料干扰大中药制剂易含有较高的重金属、砷盐和中药制剂易含有较高的重金属、砷盐和残留农药等杂质残留农药等杂质u非药用部位、泥沙非药用部位、泥沙u重金属、残留农药重金属、残留农药u包装、保管不当发生霉变、虫蛀包装、保管不当发生霉变、虫蛀u洗涤原料的水质二次污染洗涤原料的水质二次污染6 6、杂质来源复杂，需控制、杂质来源复杂，需控制v液体制剂：合剂、口服液、酊剂等v半固体制剂：煎膏剂、流浸膏v固体制剂：丸剂、散剂、片剂、胶囊剂等中国药典（中国药典（20102010年版）一部（二十六种）年版）一部（二十六种）中药制剂的分类中药
7、制剂的分类含量测定含量测定检查检查鉴别鉴别取样取样中药分析的一般程序中药分析的一般程序13 中药制剂成分的多样性和复杂性，需进行样品前处理； 前处理的目的：对待测组分进行提取、分离、纯化，排除制剂中的其他组分和辅料等干扰中药分析的样品前处理14取样供试品溶液的制备v超声提取法*v回流提取法v连续回流提取法v萃取法v水蒸气蒸馏法v超临界流体萃取法超声提取法超声提取法 利用超声波的助溶作用进行提取利用超声波的助溶作用进行提取超声波振荡器（超声波清洗器）超声波振荡器（超声波清洗器） 简便简便 省时省时 提取率高提取率高 连续回流提取法连续回流提取法样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝样品置有机溶剂
8、中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管的提取方法流回样品管的提取方法节省溶剂，提高提取效率节省溶剂，提高提取效率适宜受热稳定的药物适宜受热稳定的药物费时费时特点特点仪器仪器索氏提取器索氏提取器用于皂苷类用于皂苷类正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇氯仿氯仿氯仿氯仿乙醚、石油醚乙醚、石油醚醋酸乙酯醋酸乙酯醋酸乙酯醋酸乙酯n萃取法利用溶质在两种互不相溶的萃取法利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同溶剂中溶解度的不同用于生物碱类用于生物碱类用于黄酮类用于黄酮类用于挥发油用于挥发油18超临界流体萃取（超临界流体萃取（SFE法）法）超临界流体超临界流体是指在临界温度和临界压力以上的是指在临界温度和临界压力以上的流体
9、，介于气体与液体之间的一种物相。流体，介于气体与液体之间的一种物相。物质状态密度(g/cm3)粘度(g/cm/s)扩散系数(cm2/s)气态(0.6-2)x10-3(1-3)x10-40.1-0.4液态0.6-1.6(0.2-3)x10-2(0.2-2)x10-5SCF0.2-0.9(1-9)x10-4(2-7)x10-4超临界CO2：Pc=7.37MPa ；Tc=31.3 19超临界流体萃取法CO2萃取过程无味、无臭、无毒，安全性好；CO2价格便宜，纯度高，可循环使用；样品易浓集；药味的选取原则v单味制剂，直接进行鉴别和含测；v复方制剂，应按照君、臣、佐、使选择药味；v应首选君药、臣药、贵重
10、药、毒性药。v凡有原粉入药者，应该作显微鉴别。v原则上处方中的每一药味均应进行鉴别，选择尽量多的药味（1/3药味）。鉴别与含量测定药味的选取原则v选择明确的有效成分或类别清楚的某一选择明确的有效成分或类别清楚的某一类总成分进行含量测定类总成分进行含量测定v检测成分应归属某单一药味检测成分应归属某单一药味v检测成分应与中医用药的功能主治相近检测成分应与中医用药的功能主治相近v无法含量测定的，可测定浸出物含量无法含量测定的，可测定浸出物含量鉴别：性状鉴别显微鉴别色谱法鉴别含量测定：高效液相色谱法薄层扫描法气相色谱法含生药粉制剂丸剂、片剂、胶囊剂、散剂快速，简便，覆盖面大 显微鉴别色谱鉴别vTLC法
11、法应用最多应用最多 （Rf、颜色、荧光）、颜色、荧光）vGC法法 含挥发性成分的药物含挥发性成分的药物 vHPLC法法常与含量测定同时进行常与含量测定同时进行 处方处方 牛黄牛黄10g 10g 朱砂朱砂6060g g 黄连黄连200200g g 黄芩黄芩120120g g 栀子栀子120120g g 郁金郁金8080g g 方药分析方药分析 牛黄牛黄清热解毒药，主含胆酸类成分清热解毒药，主含胆酸类成分黄连黄连清热燥湿药，主要为小檗碱清热燥湿药，主要为小檗碱黄芩黄芩清热燥湿药，主要为黄酮类清热燥湿药，主要为黄酮类栀子栀子清热泻火药，主含栀子甙清热泻火药，主含栀子甙朱砂朱砂安神药，主含硫化汞（安神
12、药，主含硫化汞（HgSHgS）郁金郁金活血去瘀药，主含挥发油活血去瘀药，主含挥发油 示例示例 万氏牛黄清心丸万氏牛黄清心丸黄芩苷供试品黄芩空白栀子苷供试品 栀子空白检查项目检查项目意义意义方法方法水分水分贮贮藏藏过过程程中中保保证证质质量量的的中中药药指指标，霉变、粘结、成分分解标，霉变、粘结、成分分解烘干法、甲苯法、烘干法、甲苯法、减压干燥法减压干燥法总总灰灰分分和和酸酸不溶性灰分不溶性灰分控制药材中泥土、砂土的量控制药材中泥土、砂土的量炽灼残渣法炽灼残渣法重金属重金属对对人人体体有有严严重重危危害害，药药材材由由于于环环境境污污染染等等原原因因易易引引入入重重金金属属杂质，杂质，严重影响中
13、药出口严重影响中药出口干干法法、湿湿法法破破坏坏-硫硫代代乙酰胺法乙酰胺法砷盐砷盐药药材材由由于于受受除除草草剂剂、杀杀虫虫剂剂、化学肥料等影响易引入砷盐化学肥料等影响易引入砷盐古古蔡蔡法法、二二乙乙基基二二硫硫代氨基甲酸银法等代氨基甲酸银法等农药残留农药残留药药材材栽栽培培为为了了减减少少虫虫害害，喷喷洒洒农农药药，土土壤壤中中残残存存的的农农药药，含含磷、含氯，磷、含氯，严重影响中药出口严重影响中药出口氧氧瓶瓶燃燃烧烧法法(不不明明农农药药测测定定总总氯氯/磷磷量量)、GC (已知农药已知农药)、比色等、比色等中药及其制剂分析的杂质检查中药及其制剂分析的杂质检查中药制剂特有的剂型及检查项目
14、中药制剂特有的剂型及检查项目u 丸剂丸剂-水分、水分、溶散时限溶散时限u 散剂散剂-粒度（外用）、外观均匀度粒度（外用）、外观均匀度u 煎膏剂（膏滋）煎膏剂（膏滋）-相对密度、不溶物相对密度、不溶物u 流浸膏剂与浸膏剂流浸膏剂与浸膏剂-乙醇量乙醇量u 茶剂茶剂-水分、溶化性水分、溶化性u 胶剂胶剂-总灰分、重金属、砷盐总灰分、重金属、砷盐u 酒剂酒剂-乙醇量、总固体、甲醇量乙醇量、总固体、甲醇量u 露剂露剂-pH值值烘干法烘干法（不含或少含挥发性成分）（不含或少含挥发性成分）甲苯法甲苯法 （含挥发性成分）（含挥发性成分）减压干燥法减压干燥法（含挥发性成分贵重药）（含挥发性成分贵重药） GC法法
15、水分的测定水分的测定酸不溶性灰分的测定酸不溶性灰分的测定总灰分的测定总灰分的测定含量测定v限度规定限度规定v中药及其制剂中待测成分的含量限度，一般规定中药及其制剂中待测成分的含量限度，一般规定下限下限，如马鞭草按干燥品计算，含熊果酸不得少，如马鞭草按干燥品计算，含熊果酸不得少于于0.36%。v毒性中药毒性中药应规定上下限。例如马钱子按干燥品计应规定上下限。例如马钱子按干燥品计算，含士的宁应为算，含士的宁应为1.202.20%。v多植物来源的药材，如药材能区分开的，其含量多植物来源的药材，如药材能区分开的，其含量差异较大的，可制订两个指标。差异较大的，可制订两个指标。 含量测定常用定量方法常用定
16、量方法v化学分析法化学分析法v挥发油测定法挥发油测定法v分光分度法分光分度法vHPLCvGCv薄层色谱扫描法薄层色谱扫描法含量测定v相对校正因子法同时测定中药多指标成分的含量相对校正因子法同时测定中药多指标成分的含量 v原理：又称为一测多评法，是基于中药中常含有具有相似母核结构的同一类成分，通过实验计算出各成分吸收系数间稳定的相关数值，仅测定1个有对照品的目标成分，进而计算出其他同类成分的含量。v所选择的质控指标应是药材中的有效成分或指标性成分，待测成分应有相对较高的含量；样品收集应选择有代表性的药材，样本数具有统计学意义；并进行各项分析方法学指标验证。v中国药典采用此法对黄连中的表小檗碱、黄
17、连碱、巴马中国药典采用此法对黄连中的表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱进行含量测定汀、小檗碱进行含量测定 中药安全性相关的质量控制项目v重金属与砷盐检查v农药残留量分析v黄曲霉素测定：桃仁、杏仁及相应制剂v中药注射剂：重金属和有害元素限度v中药掺伪掺假和非法添加的检查v毒性成分的控制：附子：含双酯型生物碱，毒性强，采用TLC对乌头碱限量检查；重金属与砷盐检查vChP附录收载有四种重金属检查法，参见总论第5章v砷盐检查法：砷盐检查法：古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸银法v双硫腙比色法：双硫腙比色法：选择性地测定制剂中的铅v原子吸收分光光度法：原子吸收分光光度法：铅使用铅空心阴极灯测定；砷用砷空心阴极灯
18、v高效液相色谱电感耦合等离子体质谱：高效液相色谱电感耦合等离子体质谱：测定中药中不同价态重金属离子的含量残留农药种类残留农药种类v有有机机氯氯类类：六六六六六六、DDT、五五氯氯硝硝基基苯苯、艾氏剂艾氏剂v有有机机磷磷类类：磷磷酸酸酯酯类类（敌敌敌敌畏畏、敌敌百百虫虫）、硫硫代代磷磷酸酸酯酯类类（对对硫硫磷磷）、磷磷酰酰胺胺及及硫硫代代磷酰胺（甲胺磷）磷酰胺（甲胺磷）v拟除虫菊酯类拟除虫菊酯类：氯氰菊酯、溴氰菊酯氯氰菊酯、溴氰菊酯v氨基甲酸酯类氨基甲酸酯类：西维因、呋喃丹：西维因、呋喃丹农药残留量分析ChP2010ChP2010一部附录一部附录IX Q IX Q 农药残留量测定法农药残留量测定
19、法 v有机氯类农药残留量测定有机氯类农药残留量测定v色谱条件与系统适用性试验：色谱条件与系统适用性试验： vSE-54（30m 0.32mm 0.25um）或或DB-1701，63Ni- ECD电电子子捕捕获获检检测测器器。进进样样口口温温度度：230；检检测测器器温温度度：300；不不分分流流进进样样；程程序序升升温温：初初始始100，每每分分钟钟10升升至至220，每每分分钟钟8升升至至250，保保持持10分钟。分钟。v理理论论塔塔板板数数按按-BHC峰峰计计算算，不不低低于于106，分分离离度度应应大大于于1.5。 v混混合合对对照照品品溶溶液液：BHC（、-BHC） ， DDT（ PP
20、-DDE、 PP-DDD、OP-DDT、PP-DDT），五五氯氯硝硝基基苯苯（PCNB），溶溶剂剂为为石石油油醚醚（60-90）；）；v供试品溶液制备：供试品溶液制备：药材、中药制剂药材、中药制剂v进样量：进样量：1ulv按外标法计算按外标法计算9种农药残留量种农药残留量中药掺伪造假v掺杂掺伪造假掺杂掺伪造假v用白芍的根茎部分染色加工成用白芍的根茎部分染色加工成川乌、草乌川乌、草乌v用红薯染色加工成制首乌；用红薯染色加工成制首乌；v用淀粉压模制成冬虫夏草；用淀粉压模制成冬虫夏草； v西洋参掺入生晒参短枝西洋参掺入生晒参短枝v用薄纸切细丝染色掺杂于西红用薄纸切细丝染色掺杂于西红花中；花中；v滥用
21、硫磺熏蒸药材使美观和防滥用硫磺熏蒸药材使美观和防虫蛀虫蛀 莪术伪充三七的鉴别v三七具有散瘀止血、消肿定痛等功能，因其疗效显著，商品价格昂贵，一些不法商贩在利益驱动下，以廉价的莪术伪充。v莪术作用峻猛，伪充三七可能产生副作用，故应加以区别应用 v粉末显微鉴别粉末显微鉴别v薄层色谱鉴别薄层色谱鉴别 v粉末显微鉴别v三七v（1）木栓细胞呈长方形或多角形，壁薄，棕色；v（2）淀粉粒众多，单粒呈类圆形、多角形或不规则形，直径330 m；v（3）树脂道内含棕黄色滴状或块状分泌物；v（4）导管以网纹多见，直径1640 m；v（5）草酸钙簇晶稀少，棱角较钝v莪术莪术v（1）非腺毛多已呈碎片，完整者极少；v（2
22、）淀粉粒大多糊化成团块，未糊化淀粉粒多为单粒，卵圆形，短杆状，长2341 m，宽1924 m，有明显层纹；v（3、4）导管多为螺纹、梯纹，少数导管伴有杆状纤维群，纤维壁孔明显，导管及纤维均木化。 中药指纹图谱 定定义义：运运用用现现代代分分析析技技术术表表征征和和评评价价具具有有代代表表性中药化学成分群信息。性中药化学成分群信息。v“现现代代分分析析技技术术”：光光谱谱、色色谱谱、波波谱谱、联联用用技术，以及化学计量学和计算机技术等。技术，以及化学计量学和计算机技术等。v“中中药药化化学学成成分分群群”：药药材材、饮饮片片、中中药药提提取取物物和和成成药药中中与与药药理理活活性性相相关关的的，
23、由由次次生生代代谢谢产产物组成的化合物群。物组成的化合物群。v“代代表表性性”：中中药药化化学学成成分分群群信信息息须须具具有有统统计计学意义的样本数。学意义的样本数。国外应用情况v美美国国FDA允允许许草草药药类类食食品品添添加加剂剂申申报报中中可可以以提提供色谱指纹图谱。供色谱指纹图谱。vWHO在在草草药药评评价价指指导导原原则则中中规规定定若若活活性性成成分分不不明明，可可以以提提供供色色谱谱指指纹纹图图谱谱以以证证明明产产品品质质量量的的一致性。一致性。v欧欧共共体体在在草草药药质质量量评评价价的的指指南南中中指指出出，单单靠靠测测定某有效成分的稳定性是不够的。定某有效成分的稳定性是不
24、够的。v国国际际上上基基本本认认可可，草草药药色色谱谱指指纹纹图图谱谱可可以以提提供供复复杂杂成成分分的的定定性性甚甚至至定定量量信信息息，考考察察生生产产中中的的影响，控制产品的一致性。影响，控制产品的一致性。色谱指纹图谱的基本属性模糊性模糊性 强调分析、比较指纹图谱的相似性，而强调分析、比较指纹图谱的相似性，而不是完全相同。不是完全相同。是一种是一种综合的、量化的综合的、量化的色谱鉴别手段。色谱鉴别手段。整体性整体性 将指纹图谱作为一个整体来分析和比较将指纹图谱作为一个整体来分析和比较它的综合特征以达到鉴别的目的。它的综合特征以达到鉴别的目的。系系统统性性：指指图图谱谱所所反反映映的的化化
25、学学成成分分全全部部信信息息，其其中中包包括括中中药药有有效效部部位位所所含含主主要要成成分分的的种种类类，或指标成分的全部。或指标成分的全部。特特征征性性：指指图图谱谱中中反反映映的的化化学学成成分分信信息息是是具具有有高高度度选选择择性性的的，这这些些信信息息的的综综合合结结果果，将将有有助助于特征区分中药的真伪与优劣。于特征区分中药的真伪与优劣。稳稳定定性性：在在规规定定的的方方法法与与条条件件下下，不不同同的的操操作作者者和和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱。不同的实验室应能作出相同的指纹图谱。指纹图谱的制定原则指纹图谱的制定原则中药中药预处理预处理中药液相色谱中药液相色谱中药液相色
26、谱中药液相色谱分析条件分析条件分析条件分析条件分离分离色谱条件色谱条件初始化初始化指导指导指导指导方法学考察方法学考察指纹图谱指纹图谱调整色谱条件调整色谱条件调整色谱条件调整色谱条件N N其他其他其他其他1. 1.计算机辅助指纹图谱评价计算机辅助指纹图谱评价计算机辅助指纹图谱评价计算机辅助指纹图谱评价2. 2.多成分定量分析方法建立多成分定量分析方法建立多成分定量分析方法建立多成分定量分析方法建立色谱指纹图谱平台流程色谱指纹图谱平台流程中药指纹图谱中药指纹图谱工作站工作站软件软件中药体内分析v中药体内定量分析方法中药体内定量分析方法v中药药代动力学中药药代动力学v代谢组学研究代谢组学研究示例：
27、基于示例：基于RPLC-HILIC-TOFMS技术的四技术的四逆汤治疗心肌梗死作用的血清代谢组学研究逆汤治疗心肌梗死作用的血清代谢组学研究采用亲水色谱和反相色谱相结合的策略进行研究，更加全面的发现心肌梗死的血清标志物，分析四逆汤对机体的调节作用 Fig. Typical serum total ion chromatograms separated on (a) RPLC and (b) HILIC. (c) Responses of standard L-isoleucine ion m/z 132.10 on RPLCMS and HILICMS.RPLC-Q-TOFMS HILIC-Q-
28、TOFMS 对极性代谢物具有更好的保留对极性代谢物具有更好的保留对极性代谢物具有更好的保留对极性代谢物具有更好的保留 质谱响应增强，灵敏度提高质谱响应增强，灵敏度提高质谱响应增强，灵敏度提高质谱响应增强，灵敏度提高 这是得到的反相和亲水的总离子流图，以异亮氨酸为例，我们发现相同的浓度下，在亲水模式下，具有更好的质谱响应，同时，我们能够观察到，在反相体系下，其流出接近于死时间，而在亲水色谱条件下，具有更好的保留行为。Fig. PLS-DA scores plot from RPLC-MSFig. PLS-DA scores plot from HILIC-MS(a) 鞘脂代谢 (b)溶血卵磷脂代谢 (c) 脂肪酸转运的卡尼丁循环 (d) 色氨酸代谢 心梗状态下主要生物标志物的代谢变化通路以下是选择的8种标志物在三组中变化的箱形图，可以看出四逆汤对他们有明显的回调作用。思考题v中药分析有哪些特点？v中药的检查主要包括哪些项目？v凡已知有效成分、毒性成分或能反映内在质量的指标成分的药材，应进行含量测定，常用的定量方法有哪些？v解释中药指纹图谱的概念。v简述中药指纹图谱建立的方法、步骤、数据处理及评价方法。v请提问题v谢谢！
