固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸1 （－）目的要求（－）目的要求 学习固蓝盐比色法测定食品中还原型抗坏血酸含量测定学习固蓝盐比色法测定食品中还原型抗坏血酸含量测定的原理及其检测方法的原理及其检测方法 （二）实验原理（二）实验原理ØVC是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作作抗坏血酸抗坏血酸维生素维生素C属于水溶性维生素属于水溶性维生素VC广泛存在于广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会何多余量都会排出体外排出体外 2 Ø维生素维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性进一步水解则生成进一步水解则生成2，，3 -二酮古乐糖酸，失去生二酮古乐糖酸，失去生理作用。
理作用Ø水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂在酸性介质中很稳定，氯仿等大多数有机溶剂在酸性介质中很稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，既使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或易于分解，特别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏它们易受空气、光、热、酶、金属全部破坏它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素离子等的影响；维生素C对氧、铜离子敏感，易对氧、铜离子敏感，易被氧化3 Ø根据它具有的还原性质可以测定维生素根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量常用的测定方法有：的含量常用的测定方法有：Ø（（1））2，，6-二氯靛酚法二氯靛酚法 （还原型（还原型VC））Ø（（2））固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸固蓝盐比色法测定还原型抗坏血酸Ø（（3））2，，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （总（总VC））Ø（（4）碘酸法）碘酸法Ø（（5）碘量法）碘量法Ø（（6）荧光分光光度法）荧光分光光度法4 • 根据上述性质，测定水溶性维生素时，根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。
一般都在酸性溶液中进行前处理VC通常采通常采用草酸、草酸用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直醋酸溶液直接提取在一定浓度的酸性介质中，可以消接提取在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用的破坏作用草酸价廉，使用方便，对维生素草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好• 在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应反应生成黄色的草酰肼生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内酯衍生物羟基丁酰内酯衍生物可在其最大吸收波长（可在其最大吸收波长（420nm）处测定吸光）处测定吸光度，与标准系列比较定量度，与标准系列比较定量5 （三）仪器与试剂（三）仪器与试剂 1．试剂．试剂 （（1）） 2 mol／／L乙酸溶液乙酸溶液 吸取吸取 11.6 mL冰醋酸，加水稀释至冰醋酸，加水稀释至 100 mL （（2）） 0.5mol／／L乙酸溶液吸取乙酸溶液吸取29mL冰醋酸，加水稀释至冰醋酸，加水稀释至100 mL （（3）） 0.25mol／／L乙二胺四乙酸二钠溶液称取乙二胺四乙酸二钠溶液称取 9. 3g乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠（（C10H14 N2O8 Na2·2H2O）加水并加热使之溶解，冷却并稀释至）加水并加热使之溶解，冷却并稀释至100 mL。
（（4）蛋白质沉淀剂）蛋白质沉淀剂 ①①乙酸锌溶液称取乙酸锌溶液称取 22.0 g乙酸锌［乙酸锌［Zn（（CH3COO））2·2H2O］，加］，加 3mL冰醋酸冰醋酸溶于水并稀释至溶于水并稀释至100 mL ②②亚铁氰化钾溶液称取亚铁氰化钾溶液称取 10.6 g亚铁氰化钾［亚铁氰化钾［K4Fe（（CN））6· 3H2O］，加水溶］，加水溶解至解至 100 mL （（5）显色剂固蓝盐）显色剂固蓝盐 B（（Fast Blue Salt B）溶液准确称取）溶液准确称取 0.2 g固蓝盐固蓝盐 B，加水，加水于于100mL棕色容量瓶中定容该溶液在室温下贮存可稳定棕色容量瓶中定容该溶液在室温下贮存可稳定3d以上 （（6）抗坏血酸标准储备溶液精密称取）抗坏血酸标准储备溶液精密称取0．．2000 g抗坏血酸，加抗坏血酸，加 20mL 2 mol／／L乙酸溶液，溶解后移入乙酸溶液，溶解后移入 100 mL棕色容量瓶中，用水定容并混匀此溶液相当于棕色容量瓶中，用水定容并混匀此溶液相当于 2.0 mg／／mL抗坏血抗坏血酸（酸（10℃℃下冰箱内贮存可稳定下冰箱内贮存可稳定2d） （（7）抗坏血酸标准使用溶液用移液管精密吸取）抗坏血酸标准使用溶液用移液管精密吸取 5.0 mL抗坏血酸标准储备溶液抗坏血酸标准储备溶液于于100 mL棕色容量瓶内。
加棕色容量瓶内加 5 mL 2mol／／L乙酸溶液并用水定容此溶液相当于乙酸溶液并用水定容此溶液相当于 100 μg／／mL抗坏血酸（临用时配制）抗坏血酸（临用时配制）6 2．仪器．仪器可见光分光光度计；捣碎机；离心机可见光分光光度计；捣碎机；离心机 （四）实验步骤（四）实验步骤 1．样品溶液的制备．样品溶液的制备 （（1）非蛋白性食品）非蛋白性食品 ①①液体试样抗坏血酸含量在液体试样抗坏血酸含量在 0.2g／／L以下的试样，混以下的试样，混匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量匀后可直接取样测定；抗坏血酸含量 0.2 g／／L以上的试以上的试样，用水适当稀释后测定样，用水适当稀释后测定 ②②水溶性固体试样准确称取水溶性固体试样准确称取 1.0～～5.0 g，精确至，精确至 0.001 g，加，加 5 mL 2 mol／／L乙酸溶液研磨溶解后，移入乙酸溶液研磨溶解后，移入100mL棕色容量瓶内，加水定容棕色容量瓶内，加水定容 ③③蔬菜、水果样品称取鲜样可食部分蔬菜、水果样品称取鲜样可食部分20.00～～50.00 g，加等量的，加等量的2mol／／L乙酸溶液用捣碎机捣成匀浆。
称取乙酸溶液用捣碎机捣成匀浆称取 10.0～～20.0 g匀浆于匀浆于 100mL棕色容量瓶内，加棕色容量瓶内，加 5 mL 2 mol／／L乙酸溶液，用水定容，过滤备用不易过滤的样乙酸溶液，用水定容，过滤备用不易过滤的样液可用离心机离心分离，上清液供测定用液可用离心机离心分离，上清液供测定用 7 （（2）蛋白性食品固体试样混匀后精密称取）蛋白性食品固体试样混匀后精密称取5.0～～10.0g，精确至，精确至0 001g；液体试样用移液管精密吸；液体试样用移液管精密吸取取5.0～～10.0 mL于于 100mL棕色容量瓶内加棕色容量瓶内加 10 mL 2mol／／L乙酸溶液，乙酸锌溶液和亚铁氰化钾乙酸溶液，乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各溶液各75mL，加水定容将全部溶液移入离心管，加水定容将全部溶液移入离心管内，以内，以3000 r／／min离心离心10 min，上清液供测定，上清液供测定用同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸用同时取与处理试样相同量的乙酸溶液、乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空锌溶液和亚铁氰化钾溶液，按同一方法做试剂空白对照8 2．标准曲线绘制．标准曲线绘制 取一套取一套10 mL比色管，编号，按表比色管，编号，按表3－－12加入各加入各试剂。
试剂 表表3－－12 试剂配加表试剂配加表各管加水稀释至各管加水稀释至10 mL，混匀并在室温下放置，混匀并在室温下放置20 min后，后，用用1cm比色皿，以零号管为参比，于比色皿，以零号管为参比，于420 nm处测定吸光处测定吸光值以抗坏血酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲以抗坏血酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线9 绘制标准曲线方法：绘制标准曲线方法：1）绘制标准曲线）绘制标准曲线2）计算回归方程后，再绘制标准曲线）计算回归方程后，再绘制标准曲线计算回归方程方法计算回归方程方法:(1)(1)按照回归方程进行计算按照回归方程进行计算;(2)(2)应用应用excel进行计算进行计算;(3)(3)电脑连接的分光光度计直接出数据电脑连接的分光光度计直接出数据10 3．样品测定．样品测定（（1）非蛋白试样的测定）非蛋白试样的测定 于二个比色管内精密吸取按于二个比色管内精密吸取按非蛋白性食品方法处理的样液非蛋白性食品方法处理的样液0.5～～5.0 mL（约相当（约相当于抗坏血酸于抗坏血酸200 μg以下）和等量蒸馏水，以下按标准以下）和等量蒸馏水，以下按标准曲线测定方法依次加入其他试剂。
加水稀释至曲线测定方法依次加入其他试剂加水稀释至10 mL，混匀并在室温下放置，混匀并在室温下放置20 min后，以未加样品管为参后，以未加样品管为参比，测定样品吸光值，从标准曲线上查出抗坏血酸含比，测定样品吸光值，从标准曲线上查出抗坏血酸含量 （（2）蛋白性试样的测定）蛋白性试样的测定 于两个于两个 10mL比色管内比色管内精密吸取按蛋白性食品方法制备的样液（约相当于抗精密吸取按蛋白性食品方法制备的样液（约相当于抗坏血酸坏血酸 200 μg以下）和等体积试剂空白溶液各加以下）和等体积试剂空白溶液各加入入 1.5 mL乙二胺四乙酸二钠溶液、乙二胺四乙酸二钠溶液、0.5 mol／／L乙醇乙醇溶液溶液1.0 mL、、1.25mL固蓝盐固蓝盐B溶液，加水定容室溶液，加水定容室温下放置温下放置3min后，移入后，移入1 cm比色皿，以试剂空白管比色皿，以试剂空白管为参比，于为参比，于420 nm处测定吸光值从标准曲线上查处测定吸光值从标准曲线上查出抗坏血酸含量出抗坏血酸含量11 （五）结果计算（五）结果计算 按式（按式（3－－14）计算样品中抗坏血酸含量，）计算样品中抗坏血酸含量，计算结果保留小数点后二位。
计算结果保留小数点后二位式中式中 X——每百克（或百毫升）样品中抗坏血酸含量，每百克（或百毫升）样品中抗坏血酸含量，mg；； C——试样测定液中抗坏血酸含量，试样测定液中抗坏血酸含量，μg；； m——试样质量或体积，试样质量或体积，g或或mL；； V2——试样处理液总体积，试样处理液总体积，mL；； V1——测定时所取溶液体积，测定时所取溶液体积，mL12 （六）注意事项及说明（六）注意事项及说明 1．蛋白性食品常指奶粉、豆粉、乳饮料、强化．蛋白性食品常指奶粉、豆粉、乳饮料、强化食品等 2．蛋白性试样比色测定时，以试剂空白管为参．蛋白性试样比色测定时，以试剂空白管为参比的目的，在于消除蛋白质沉淀剂可能产生的呈色比的目的，在于消除蛋白质沉淀剂可能产生的呈色物质，减少实验误差物质，减少实验误差 （七）思考题（七）思考题 1．比较．比较 2，，4二硝基苯肼法与固蓝盐二硝基苯肼法与固蓝盐 B比色法测比色法测定抗坏血酸的适用性定抗坏血酸的适用性 2．样品溶液制备时加入乙酸溶液有何目的？对．样品溶液制备时加入乙酸溶液有何目的？对蛋白性食品若不进行除蛋白步骤，会对实验产生哪蛋白性食品若不进行除蛋白步骤，会对实验产生哪些影响？些影响？13 。