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1、1课程主要内容课程主要内容v第一章第一章 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化v第二章第二章 分子生物学常用技术（分子生物学常用技术（PCRPCR、核、核 酸分子杂交、基因测序等）酸分子杂交、基因测序等）v第三章第三章 基因工程基因工程v第四章第四章 细胞培养技术细胞培养技术2v第一节第一节 DNADNA重组技术重组技术( (分子克隆分子克隆) )v第二节第二节 分子克隆的工具酶分子克隆的工具酶v第三节第三节 分子克隆的载体（分子克隆的载体（vectorvector）v第四节第四节 分子克隆的一般过程分子克隆的一般过程v第五节第五节 克隆基因的表达克隆基因的表达第第3 3 章章 基因工程基
2、因工程 3 基因工程基因工程（gene engineering gene engineering ）：）： 将目的基因进行克隆将目的基因进行克隆( (基因与载体的体外重组基因与载体的体外重组) )，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及物，或定向改造细胞和生物个体的特性所用的方法及相关的工作相关的工作。 上游技术上游技术DNA重组技术重组技术(分子克隆分子克隆)下游技术下游技术基因表达基因表达基因工程的基本特点：基因工程的基本特点：分子水平操作分子水平操作(DNA)， 细胞水平表达细胞水平表达。
3、 4CohenCohen的的重重组组DNADNA实验实验 DNADNA重组（重组（DNA DNA recombinationrecombination）：）： 指不同来源的指不同来源的DNADNA分子通过磷酸分子通过磷酸二酯键将末端连接二酯键将末端连接形成重组形成重组DNADNA分子。分子。5DNADNA重组技术重组技术（DNA recombinant technology）v也称分子克隆，指在也称分子克隆，指在DNADNA水平上，将目的基因水平上，将目的基因在体外重组于能自我复制的载体在体外重组于能自我复制的载体DNADNA分子上，分子上，然后将重组然后将重组DNADNA导入宿主细胞中进行增
4、殖，以导入宿主细胞中进行增殖，以获得大量的目的获得大量的目的DNADNA片段的过程片段的过程。6DNA重重组组技技术术7目的基因的分离目的基因的分离切切 目的基因与载体的连接（重组目的基因与载体的连接（重组DNADNA）接接重组体导入受体细胞（宿主细胞）重组体导入受体细胞（宿主细胞）转转阳性重组体的筛选和鉴定阳性重组体的筛选和鉴定筛筛基基本本步步骤骤以以研研究究或或应应用用为为目目的的、所所需需要要的的基基因因或或基基因因克克隆隆群群体体（外外源源基基因因或靶基因）。或靶基因）。 8基基因因工工程程9基因工程技术的应用基因工程技术的应用 一、生产（基因工程）产品：一、生产（基因工程）产品： 1
5、.1.构建基因组文库，构建基因组文库，cDNAcDNA文库，核酸探针等；文库，核酸探针等； 2. 2. 生生产产基基因因的的( (用用于于医医药药目目的的) )的的一一级级产产品品，即即蛋蛋白白质质、多多肽肽；二二级级产产品品，如如维维生生素素、多多糖糖、氨氨基基酸酸( (因因为为它它们们由由酶酶催催化产生）；化产生）； 3. 3. 生产生产基因疫苗基因疫苗，如，如: :乙肝疫苗；乙肝疫苗； 4.4.转基因动物与植物转基因动物与植物 二、改良生物的性状二、改良生物的性状 如将固氮基因引入水稻如将固氮基因引入水稻, ,就可以不用施氮肥了就可以不用施氮肥了 基因治疗基因治疗 三、分子诊断三、分子诊
6、断 10 在分子克隆技术中，对在分子克隆技术中，对DNADNA进行进行切割切割、合成合成、补平补平、连接连接和和修饰修饰等工具酶是必不可少的。等工具酶是必不可少的。常用的常用的工具酶工具酶主要有：主要有： 限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶、DNADNA聚合酶聚合酶、逆转、逆转录酶、录酶、DNADNA连接酶、碱性磷酸酶、核酸酶和末端连接酶、碱性磷酸酶、核酸酶和末端脱氧核苷酸转移酶脱氧核苷酸转移酶、甲基化酶等。甲基化酶等。工具酶工具酶（tool enzyme) 11一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction restriction restr
7、iction restriction endonucleaseendonucleaseendonucleaseendonuclease，RERERERE） 简称简称限制酶限制酶，是一类能是一类能识别识别和和切割切割特定特定DNADNA序列的序列的核酸内切酶核酸内切酶，为原核生物所特有。，为原核生物所特有。 分为三型。其中分为三型。其中型型被称为基因工程的被称为基因工程的分分子剪刀子剪刀，是分子克隆技术中最重要的工具酶。，是分子克隆技术中最重要的工具酶。12作用作用 三种限制性核酸内切酶的作用三种限制性核酸内切酶的作用 酶活性酶活性 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切
8、酶 甲基化酶甲基化酶 甲基化酶甲基化酶 ATPATP酶酶 DNADNA解旋酶解旋酶DNADNA链上的链上的 无无 有有 有有特异识别位点特异识别位点DNADNA链上的链上的 无无 在识别序列内在识别序列内 在识别序列外在识别序列外特异切割位点特异切割位点在分子克隆中在分子克隆中 无无 有有 无无的重要意义的重要意义13 限制酶的命名与分类限制酶的命名与分类EcoR I产生该酶的产生该酶的宿主菌宿主菌属名属名微生物微生物的的种名种名 宿主菌的宿主菌的株或型株或型同一菌株中不同同一菌株中不同限制酶的限制酶的编号编号（按发现先后顺序）（按发现先后顺序） 大肠杆菌大肠杆菌EscherichiaEsch
9、erichia属属、colicoli种种、RY13RY13株株中中 分离到几种限制酶，分别表示为分离到几种限制酶，分别表示为: : EcoREcoR I I 、EcoREcoR 、EcoREcoR 等。等。14型限制性核酸内切酶的作用模式型限制性核酸内切酶的作用模式 根根据据需需要要在在特特定定的的位位点点上上精精确确切切割割双双链链DNADNA分子，产生特异末端的分子，产生特异末端的DNADNA片段。片段。 识别序列：识别序列：双链双链DNADNA特异的特异的碱基对（一般碱基对（一般4 4 6 6个）个）， 在识别序列内在识别序列内特特异切割异切割DNADNA。断裂磷酸二酯键断裂磷酸二酯键1
10、5 型型限制酶的特异识别序列限制酶的特异识别序列回文结构回文结构（palindrome structurepalindrome structure）：）： 指双链指双链DNADNA分子上按对称轴排列的反向互补序列。分子上按对称轴排列的反向互补序列。5 GAATTC3 ATATGC5 3 EcoR 识别序列识别序列：对称轴对称轴3 CTTAAG5 16 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionrestrictionrestrictionrestriction endonucleaseendonucleaseendonucleaseendonucle
11、ase，RERERERE） 简称简称限制酶限制酶，是一类能是一类能识别识别和和切割切割特定特定DNADNA序序列的核酸列的核酸内切酶内切酶，为原核生物所特有。，为原核生物所特有。 黏性末端黏性末端（cohesive/sticky endcohesive/sticky end） 平末端平末端（blunt endblunt end） 17 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionrestrictionrestrictionrestriction endonucleaseendonucleaseendonucleaseendonuclease，RERE
12、RERE） 简称简称限制酶限制酶，是一类能是一类能识别识别和和切割切割特定特定DNADNA序序列的核酸列的核酸内切酶内切酶，为原核生物所特有。，为原核生物所特有。 黏性末端黏性末端（cohesive/stickycohesive/stickyendend）：）： 指指限限制制酶酶错错位位切切开开两两条条对对称称轴轴互互补补DNADNA双双链链所所产产生的生的带单链突出带单链突出的末端的末端。平末端平末端（blunt endblunt end）：）： 指指限限制制酶酶在在对对称称轴轴上上同同时时切切割割互互补补DNADNA双双链链所所产产生生的末端。的末端。18黏性末端黏性末端（cohesive
13、cohesiveendend）： 指指限限制制酶酶错错位位切切开开两两条条对对称称轴轴互互补补DNADNA双双链链所产生的所产生的带单链突出带单链突出的末端的末端。GAATTCCTTAAG平末端平末端（blunt endblunt end）： 指指限限制制酶酶在在对对称称轴轴上上同同时时切切割割互互补补DNADNA双双链链所产生的末端。所产生的末端。EcoRCCC GGGGGG CCCSma19Cohesive/Sticky end20212223异源同工酶异源同工酶（isoschizomersisoschizomers）: :来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。来源不同，但能识别和切割同一
14、位点的酶。 这些同工异源酶可以这些同工异源酶可以互相代用互相代用。如：如：BamH 和和Bst （G GATCC）；）； Xho 和和 Pae R7（C TCGAG）。）。24 如：如： BamH （G GATCC） 和和Sau 3A （N GATCN）。）。 同尾酶同尾酶（isoaudamersisoaudamers）: : 识别序列不同，但可产生相同粘性末端的限制酶识别序列不同，但可产生相同粘性末端的限制酶。 产生的产生的DNADNA片段可借片段可借粘性末端粘性末端相互连接，在相互连接，在DNADNA重组重组时具有更大的时具有更大的灵活性灵活性。25限制性内切酶反应影响因素限制性内切酶反应
15、影响因素 vDNA的纯度和结构的纯度和结构 v反应缓冲液的反应缓冲液的pH值及离子浓度值及离子浓度 v酶解温度和时间酶解温度和时间 v限制酶：根据实验目的加以选择限制酶：根据实验目的加以选择 26“分子剪刀分子剪刀”的用途的用途改造和组建质粒改造和组建质粒组建基因组组建基因组DNADNA物理图谱物理图谱基因组基因组DNADNA同源性研究同源性研究DNADNA重组克隆及亚克隆重组克隆及亚克隆DNADNA杂交与序列分析杂交与序列分析271 1、DNADNA连接酶连接酶(DNA (DNA ligaseligase,“,“缝纫缝纫”针针) ) 2 2、DNADNA聚合酶聚合酶3 3、碱性磷酸酶、碱性磷
16、酸酶4 4、核酸酶、核酸酶二、其他工具酶二、其他工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(“(“分子剪刀分子剪刀”) )281 1、DNADNA连接酶连接酶 (“(“缝纫针缝纫针”) )2 2、DNADNA聚合酶（聚合酶（DNADNA合成）合成）3 3、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶4 4、核酸酶、核酸酶 二、其他工具酶二、其他工具酶291.DNA1.DNA连接酶（连接酶（DNA DNA ligaseligase） 一种封闭一种封闭DNADNA链上缺口的酶，催化链上缺口的酶，催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5磷酸基和磷酸基和3 3羟基末端形成磷酸二酯键。羟基末端形成磷酸二酯键。30 大肠杆菌大肠杆菌
17、DNADNA连接酶连接酶只能连接粘性末端，而只能连接粘性末端，而T T4 4DNADNA连接酶连接酶既能连接粘性末端，又能连接平末端。既能连接粘性末端，又能连接平末端。31粘粘性性末末端端的的特特异异性性连连接接32 5 3 外切酶外切酶 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切酶外切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 KlenowKlenow 片段片段 N C 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外外切酶切酶36kD (小小) 76kD(大大) C N枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶 DNADNA聚合酶聚合酶和和KlenowKlenow片段片段 修复修复DNADNA的的3 3末端；合成双链末端；合成双链cDNAc
18、DNA的第二链；的第二链；标记探针；标记探针；DNADNA序列分析；序列分析；33l 是一种是一种耐热耐热的的DNADNA聚合酶，分子量聚合酶，分子量65KD65KD，最佳作用，最佳作用温度是温度是7272。l TaqTaq酶具有酶具有5 5 33 聚合酶活性和依赖于聚合作用聚合酶活性和依赖于聚合作用的的5 5 33 外切酶活性外切酶活性( (无校正功能无校正功能) )。l可用于可用于DNADNA测序测序及聚合酶链反应（及聚合酶链反应（PCRPCR）。）。 TaqTaq DNA DNA聚合酶（简称聚合酶（简称TaqTaq酶）酶）34 RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性（聚合酶活性（
19、RDDPRDDP）。）。 核糖核酸酶核糖核酸酶H H活性（活性（RNaseHRNaseH） 。 DNADNA聚合酶活性（聚合酶活性（DDDPDDDP）。）。逆转录酶的作用合成逆转录酶的作用合成cDNA： 逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） 是依赖是依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶，它以聚合酶，它以RNARNA为模为模板，板，4 4种种dNTPdNTP为底物，催化合成为底物，催化合成DNADNA，此过程此过程称为逆转录过程。逆转录酶是称为逆转录过程。逆转录酶是多功能酶多功能酶。 35 在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷
20、酸转在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链移到单链或双链DNADNA分子的分子的3 3 末端末端-OH-OH上。上。特点：不需要模板特点：不需要模板DNADNA。末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶），简称末端转移酶）末端转移酶的功能主要有：末端转移酶的功能主要有：同聚物加尾同聚物加尾 标记探针标记探针 构建人工黏性末端构建人工黏性末端36( (A、G、C、T) )n nOH5 5 335 5 33OH5 5 3 3 5 5 33( (A、G、C、T) )n n Mg2+dN
21、TPnppiMg2+dNTPnppi5 5 33OH5 5 33OH 5 5 335 5 33( (A、G、C、T) )n n Co2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi （1 1）底物是）底物是单链单链DNADNA或有或有3 3 突出末端突出末端的双链的双链DNADNA，需要需要MgMg2+2+。（2 2）底物是）底物是平端平端或或5 5 突出末端突出末端的双链的双链DNADNA，需要需要CoCo2+2+。 ( (A、G、C、T) )n n37 3、碱性磷酸酶碱性磷酸酶（alkaline alkaline phosphatasephosphatase，AKPAKP） 催化催化去除去除D
22、NADNA、RNARNA或或dNTPdNTP上的上的 5 5 - -磷酸基团磷酸基团。主要用途有：主要用途有： 防止防止载体载体DNADNA自身环化，提高重组效率自身环化，提高重组效率。 5 - pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 - CpGpC -OH 3 5 -p3 -HO5 -HO3 -HO38碱性磷酸酶防止自身环化碱性磷酸酶防止自身环化39 4 4、核酸酶、核酸酶S1S1 水解水解DNADNA或或RNARNA分子中的单链部分。分子中的单链部分。其主要作用有：其主要作用有： 变粘性末端为变粘性末端为平末端平末端。 去除去除发夹结构发夹结构。 分析分析RNARNA的茎环结构和
23、的茎环结构和DNA-RNADNA-RNA分子的杂分子的杂交情况。交情况。 40核酸酶核酸酶S1S1功能：功能： 水解水解双链双链DNADNA、RNARNA或或DNA-RNADNA-RNA杂交体中的杂交体中的单链部分单链部分。核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1+ +41v第一节第一节 DNADNA重组技术重组技术v第二节第二节 分子克隆的工具酶分子克隆的工具酶v第三节第三节 分子克隆的载体（分子克隆的载体（vectorvector）v第四节第四节 分子克隆的一般过程分子克隆的一般过程v第五节第五节 克隆基因的表达克隆基因的表达第第3 3章章 基因工程基因工程 42D D
24、N NA A重重组组技技术术43 指能携带外源指能携带外源DNADNA片段进入宿主细胞进行片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。扩增或表达的工具。载体的本质为载体的本质为DNADNA。 制备的制备的目的基因目的基因必须与合适的必须与合适的载体载体连接形连接形成重组体成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表才能进入受体细胞并进行复制和表达。达。-DNADNA重组重组 载体（载体（vectorvector）: :第三节第三节 分子克隆的载体分子克隆的载体 44 自我复制自我复制能力；能力； 带有带有遗传筛选遗传筛选标记（抗药性、营养缺陷型、显标记（抗药性、营养缺陷型、显色表型反应等）色表型反应等）
25、 。 具较高的具较高的拷贝数拷贝数，易与宿主细胞的染色体分开，易与宿主细胞的染色体分开，便于分离提纯便于分离提纯 ； 有适当的有适当的限制酶切位点限制酶切位点，便于外源基因的插入，便于外源基因的插入和筛选。和筛选。具有较高的遗传具有较高的遗传稳定性稳定性。载体载体应具备的特征：应具备的特征：45 常用载体：常用载体： 质粒质粒DNA DNA 噬菌体噬菌体DNA DNA 病毒病毒DNADNA plasmid phage virus plasmid phage virus 按来源分类：按来源分类： 质粒、噬菌体、黏性质粒、酵母质粒、噬菌体、黏性质粒、酵母和和病毒病毒等等改造改造后才能成为载体。后才
26、能成为载体。 46 克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)： 用于克隆和扩增某一目的基因，为研究提供材料用于克隆和扩增某一目的基因，为研究提供材料或建立基因库。或建立基因库。 表达载体表达载体(expression vector)： 是指能将目的基因在受体细胞中有效转录和正确是指能将目的基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的功能性载体。翻译的功能性载体。 按功能分类按功能分类: : 穿梭载体穿梭载体(shutter vector)(shutter vector)： 指在两种宿主生物体内复制的载体分子指在两种宿主生物体内复制的载体分子 。 47 质粒（质粒
27、（plasmidplasmid）DNADNA 独立于染色体外，非宿主生长所必需，能独立于染色体外，非宿主生长所必需，能进行自主复制和遗传的双链环状进行自主复制和遗传的双链环状DNA分子。分子。一、克隆载体一、克隆载体48（一）质粒克隆载体（一）质粒克隆载体49插入失活插入失活 双抗生素筛选法双抗生素筛选法 50 重组体的筛选重组体的筛选双抗生素对照筛选双抗生素对照筛选可能的可能的阳性克隆（含目的基因）：阳性克隆（含目的基因）：3 3和和5 551pUC18pUC18、pUC19pUC19质粒载体质粒载体52 载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的DNA片段
28、片段（lacZ 基因基因），该基因编码），该基因编码 -半乳糖苷酶氨基端的一个片半乳糖苷酶氨基端的一个片段，异丙基段，异丙基- -D-硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）可诱导此片段合成，）可诱导此片段合成，而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型而此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 -半乳糖苷酶实现半乳糖苷酶实现基基因内互补（因内互补（ -互补互补），形成完整的），形成完整的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。53 - -半乳糖苷酶能催化指示剂底物半乳糖苷酶能催化指示剂底物5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- - -D-D-半乳糖苷（半乳糖苷（X-galX-gal）形成蓝色菌落。）形成蓝色菌落。
29、pUCpUC载体的载体的lacZlacZ 基因中含基因中含有有MCSMCS，当外源基因插入当外源基因插入MCSMCS，laclac - -肽基因阅读框架被破坏，肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无细菌内将无 - -半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 蓝白斑筛选蓝白斑筛选54pUC18pUC18、pUC19pUC19质粒载体质粒载体55 多克隆位点（多克隆位点（multiple cloning sitesmultiple cloning sites，MCSMCS） 一一段段人人工工合合成成的的DNADNA序序列列，含含有有密密集集排排列列的的多多种种限限制制性性内内切切酶酶识识
30、别序列别序列，以利于不同来源的外源，以利于不同来源的外源DNADNA片段插入载体。片段插入载体。 56（一）质粒克隆载体：（一）质粒克隆载体：用于保存和扩增用于保存和扩增 10Kb 10Kb目的目的DNADNA。（二）噬菌体载体（二）噬菌体载体 噬菌体载体和噬菌体载体和M13M13噬菌体载体噬菌体载体57 噬菌体载体噬菌体载体 58主要用途：主要用途： 插入外源基因在插入外源基因在10kb-22Kb10kb-22Kb之间之间, ,主要用于构主要用于构建建cDNAcDNA文库和基因组文库。文库和基因组文库。 重组噬菌体重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的体分子
31、量大小的75%75%105%105%之间。之间。59 M13M13噬菌体噬菌体 是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含一约是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含一约6.4Kb6.4Kb的的单链（正链）闭环单链（正链）闭环DNADNA分子分子。 在细菌内呈溶源状态生长，在适当条件下可在细菌内呈溶源状态生长，在适当条件下可生成百余个过渡形式的双链环状复制型生成百余个过渡形式的双链环状复制型DNADNA，成熟成熟的噬菌体以单链（正链）形式释放到培养液。的噬菌体以单链（正链）形式释放到培养液。 M13M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞，故可从细菌培养液的
32、上清液中获得溶解宿主细胞，故可从细菌培养液的上清液中获得噬菌体。噬菌体。60M13M13M13M13噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pIIpII蛋白蛋白造缺口造缺口355335滚环复制滚环复制释出单链释出单链DNA(DNA(正链正链) )经经pIIpII蛋白蛋白剪切剪切进入下进入下一循环一循环M13M13噬菌体载体噬菌体载体 主要用于目的主要用于目的DNADNA的的测序测序和和单链探针的制备单链探针的制备，克隆的外源，克隆的外源DNADNA一般一般1Kb1Kb。 61（三）
33、黏性质粒（三）黏性质粒( (cosmidcosmid) )特点：特点：具有质粒特征具有质粒特征( (环状环状, ,双链双链) )； 具具噬菌体载体特征噬菌体载体特征( (coscos区区) )； 具有高容量的克隆能力（具有高容量的克隆能力（40-50kb40-50kb）；）； cosmidcosmid是由是由质粒质粒和和 噬菌体噬菌体的的coscos位点构建而成。位点构建而成。 主要用于构建基因组文库。主要用于构建基因组文库。 62加入加入 噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于 噬菌体噬菌体的具感染能力的颗粒，更易进入大肠杆菌的具感染能力的颗粒，
34、更易进入大肠杆菌。粘粒进入细菌后则完全失去粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体噬菌体的功能，而表现的功能，而表现质粒质粒的特性。的特性。特点：特点：粘粒（粘性质粒）载体大小为粘粒（粘性质粒）载体大小为4 46Kb6Kb，而而插入外源插入外源基因长达基因长达404050kb50kb。用途：用途： 克隆大片段克隆大片段DNADNA； 构建小的重叠群以进行构建小的重叠群以进行DNADNA测序；测序； 63（四）（四）酵母细胞中克隆基因常用载体酵母细胞中克隆基因常用载体 酵母是研究真核生物酵母是研究真核生物DNADNA复制、重组、基因表达和调控复制、重组、基因表达和调控过程的理想材料过程的理想材料; ; 酵
35、母人工染色体（酵母人工染色体（yeast artificial chromosomeyeast artificial chromosome，YACYAC）是利用是利用酵母染色体酵母染色体DNADNA和和大肠杆菌大肠杆菌pBR322pBR322改造而成，改造而成，可可以以插入长达插入长达1 000 Kb1 000 Kb的外源的外源DNADNA片断。片断。 将质粒与酵母将质粒与酵母DNADNA重组已构建了许多重组已构建了许多YACYAC载体，根据其复载体，根据其复制方式不同分为制方式不同分为三型三型：整合型（：整合型（YIPYIP）、）、复制型（复制型（YRPYRP）和附和附加体型（加体型（YEP
36、YEP）载体，其中载体，其中YRPYRP型质粒中插入酵母染色体的着型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区，构成酵母着丝粒质粒（丝粒区，构成酵母着丝粒质粒（YCPYCP）载体。载体。64（五）动物细胞基因克隆的载体（五）动物细胞基因克隆的载体 已构建并经常使用的动物病毒克隆载体：已构建并经常使用的动物病毒克隆载体： 猿猴空泡病毒猿猴空泡病毒4040（simian simian vacuolatingvacuolating virus 40virus 40，SV40SV40）载体载体、 腺病毒腺病毒（adenovirusadenovirus）载体载体、 逆转录病毒逆转录病毒（retrovirusretr
37、ovirus）载体载体等等 65 外源基因在细胞中表达需要重要调控元外源基因在细胞中表达需要重要调控元件，是在克隆载体（复制原点，多克隆位点件，是在克隆载体（复制原点，多克隆位点, ,筛选标记）的基础上导入筛选标记）的基础上导入表达调控元件：表达调控元件：二、表达载体二、表达载体 转录相关元件；转录相关元件； 翻译相关元件；翻译相关元件； 66 ( (一一) )原核表达载体原核表达载体 真核基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于真核基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的基因的有效转录有效转录、mRNAmRNA正确的翻译正确的翻译和和翻译后修饰翻译后修饰。 有效转录有效转录 转录起始转录起始 转录
38、终止转录终止 转录效率转录效率 转录后修饰转录后修饰 原核启动子原核启动子终止子终止子强启动子，如强启动子，如trc启动子启动子mRNA剪接内含子切除剪接内含子切除cDNA67有效翻译有效翻译v 必须保证外源基因插入方向的正确性必须保证外源基因插入方向的正确性v翻译起始：翻译起始： 核糖体结合位点核糖体结合位点( (SDSD序列序列) )，起始密码子，起始密码子（AUGAUG）68 原核生物特有的、位于原核生物特有的、位于mRNAmRNA上上起始密码子起始密码子上游的上游的一段富含一段富含嘌呤（嘌呤（AGGA)AGGA)碱基的短序列，是碱基的短序列，是mRNAmRNA与与核糖核糖体小亚基结合位
39、点体小亚基结合位点，直接影响翻译效率，又称为核，直接影响翻译效率，又称为核糖体结合位点（糖体结合位点（ribosomal binding siteribosomal binding site，RBSRBS）。）。SD序列（序列（Shine-Dalgarno)69有效翻译有效翻译v 必须保证外源基因插入方向的正确性必须保证外源基因插入方向的正确性v翻译起始：翻译起始： 核糖体结合位点核糖体结合位点( (SDSD序列序列) )，起始密码子，起始密码子（AUGAUG）v阅读框架（三联体密码）阅读框架（三联体密码）v翻译后修饰翻译后修饰（肽链折叠，二硫键生成，肽段切除，（肽链折叠，二硫键生成，肽段切除
40、，侧链化学修饰磷酸化，糖基化，乙酰化等）侧链化学修饰磷酸化，糖基化，乙酰化等）70原核表达载体原核表达载体71报告基因（报告基因（reporter reporter genegene） 为了判断某一待测为了判断某一待测DNADNA序列的生物活性，常采用序列的生物活性，常采用报告基因（报告基因（reporter genereporter gene）方法。）方法。 报告基因报告基因是指处于待测基因下游并通过转录和是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报报道基因道基因，如，如绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（green fluor
41、escent green fluorescent protein protein ，GFPGFP） 基因。基因。 72报告基因报告基因绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）73(二二) 真核表达载体真核表达载体 1 1原原核核DNADNA序序列列 包包括括能能在在大大肠肠杆杆菌菌中中自自身身复复制制的的复制子和抗药基因的筛选标记。复制子和抗药基因的筛选标记。 2 2真真核核表表达达调调控控元元件件, ,包包括括启启动动子子（promoterpromoter）、增增强强子子（enhancerenhancer）、终终止止子子（terminator
42、terminator）和和加加polyApolyA信号等。信号等。 3 3真真核核细细胞胞的的复复制制起起始始序序列列、筛筛选选标标记记和和多多克克隆隆位位点点等等 74猴空泡病毒猴空泡病毒SV40SV40载体；载体； 腺病毒载体腺病毒载体；慢病毒载体慢病毒载体；腺相关病毒载体腺相关病毒载体；逆逆转转录录病病毒毒载载体体（RousRous肉肉瘤瘤病病毒毒载载体体和和鼠鼠类类的乳腺瘤病毒（的乳腺瘤病毒（MMTVMMTV）载体）；载体）； 病毒表达载体：病毒表达载体：75酵母穿梭载体示意图酵母穿梭载体示意图酵母穿梭载体示意图酵母穿梭载体示意图 酵母复制起始区酵母复制起始区酵母酵母YRP型型 穿梭载
43、体穿梭载体Ampr酵母酵母Leu 2 细菌复制起始区细菌复制起始区 转化大肠杆菌转化大肠杆菌Amps 细胞细胞转化酵母转化酵母Leu细胞细胞质粒可在大肠杆菌质粒可在大肠杆菌 和酵母之间穿梭和酵母之间穿梭76切切接接转转筛筛第四节第四节 分子克隆的一般过程分子克隆的一般过程获取获取目目的基因的基因和载体和载体目的基因和目的基因和载体连接载体连接重组重组DNADNA导导入受体细胞入受体细胞重组体的筛选重组体的筛选与鉴定与鉴定分分限制酶切割限制酶切割限制酶切割限制酶切割771.1.从基因文库中获取从基因文库中获取2.PCR -2.PCR -最常用最常用3.3.人工合成人工合成DNADNA片段片段4.
44、4.直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离中分离 目的基因目的基因： 指被研究的某一基因或指被研究的某一基因或DNADNA序列，序列，即需要克隆或表达的基因。即需要克隆或表达的基因。（一）已知基因的获得（一）已知基因的获得78 1.1.从基因文库中获取从基因文库中获取 基因组文库（基因组文库（genomic librarygenomic library，G-G-文库）文库）是指是指含有某种生物全部基因组含有某种生物全部基因组DNADNA的重组的重组DNADNA克隆群。克隆群。 构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体构建基因组文库时，先将原核或真核细胞染色体DNADNA提纯，通过机械或限
45、制酶切使之成为一定大小的提纯，通过机械或限制酶切使之成为一定大小的片段，将其与适当的载体（一般为片段，将其与适当的载体（一般为 噬菌体载体）相噬菌体载体）相连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同连接，经体外包装、转染细菌，得到一组含不同DNADNA片段的重组噬菌体颗粒。片段的重组噬菌体颗粒。 79基因组文库技术基因组文库技术( (引自引自GriffithsGriffiths et al et al.1996) .1996) 从基因组文库获取目的基因从基因组文库获取目的基因80基因组文库特点基因组文库特点 u 含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因组含有基因组内全部基因片段，是一个贮存基因
46、组全部序列的信息库（含内含子等）；全部序列的信息库（含内含子等）；u真核细胞真核细胞G-G-文库文库DNADNA中含有较多的重复序列与内含中含有较多的重复序列与内含子，一个单拷贝基因只占基因组的子，一个单拷贝基因只占基因组的1010-7-71010-5 -5 ； u具有种属特异性，但无组织特异性；具有种属特异性，但无组织特异性； 81 cDNAcDNA文库（文库（cDNAcDNA library library）：）： 以细胞全部以细胞全部mRNAmRNA经逆转录，制备出全套的经逆转录，制备出全套的cDNAcDNA克克隆集合，又称为隆集合，又称为C-C-文库文库。 C-C-文库中，平均一个目的
47、基因所对应的文库中，平均一个目的基因所对应的mRNAmRNA占总占总mRNAmRNA的的1010-4-41010-3-3，相比之下后者比前者在含量上提，相比之下后者比前者在含量上提高高2 23 3个数量级，个数量级，便于提取一个目的基因。便于提取一个目的基因。 体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。体现实时表达的信息，不包含全部遗传信息。 既有种属特异性，又有组织特异性；既有种属特异性，又有组织特异性； 82以以mRNAmRNA为模板，利用为模板，利用逆转录酶合成与逆转录酶合成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA（cDNAcDNA) )，再复制成双链再复制成双链cDNAcDNA片片段，
48、与适当载体连接段，与适当载体连接后转入受体菌，即获后转入受体菌，即获得得cDNAcDNA文库。文库。cDNAcDNA文库构建文库构建( (引自引自Old & Primrose,1980) Old & Primrose,1980) 从从cDNAcDNA文库获取目的基因文库获取目的基因83 2.PCRPCR 应用较广泛。使用应用较广泛。使用前提前提是目的基因的序列至少部分是目的基因的序列至少部分已知已知, ,以便设计引物。以便设计引物。 特点：特点：短时间获得大量短时间获得大量DNADNA片段。片段。 高保真酶高保真酶/ /测序验证！测序验证！84 3.3.人工合成人工合成DNADNA片段片段 根
49、据已知某种根据已知某种基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列或某种或某种基因产物基因产物的氨基酸序列的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用列，再用DNADNA合成仪人工合成目的基因。合成仪人工合成目的基因。 适用于合成适用于合成分子量较小的目的基因分子量较小的目的基因 （100bp100bp以内）以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、，如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。胸腺素及胰岛素原的基因等。854.4.直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离目的基因中分离目的基因 根据染色体根据染色体DNADN
50、A的限制性内切酶图谱，用适当的限的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体制性内切酶切割染色体DNADNA、分离目的基因。本方法分离目的基因。本方法适适用于制备原核生物目的基因用于制备原核生物目的基因，其原因为：，其原因为：（1 1）真核细胞染色体）真核细胞染色体DNADNA有有丰富的内含子丰富的内含子，它们在原，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。核细胞中转录后不能被剪接。（2 2）真核细胞的基因多数为）真核细胞的基因多数为单拷贝单拷贝，难以分离到足够，难以分离到足够量的目的基因。量的目的基因。 86 （二）未知基因的获得（二）未知基因的获得v构建基因组文库构建基因组文库v构建构建cD
51、NA文库文库 vmRNA差异显示技术筛选差异差异显示技术筛选差异表达基因表达基因v差异蛋白质谱表达技术筛选功差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因能基因 正正常常组组织织肿肿瘤瘤组组织织87 噬菌体噬菌体和和粘性质粒载体粘性质粒载体常用来构建常用来构建基因组文库基因组文库；构建构建cDNAcDNA文库文库和克隆和克隆较小较小DNADNA片段片段常用常用pUCpUC系列系列等质粒；等质粒；M13M13噬菌体噬菌体则用于克隆一些则用于克隆一些待测的待测的DNADNA序列序列。 这些载体不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞，这些载体不仅可以携带外源基因片段进入宿主细胞，而且还可以使外源基因在宿主细胞中表达
52、。而且还可以使外源基因在宿主细胞中表达。 常用的宿主细胞是大肠杆菌。常用的宿主细胞是大肠杆菌。 二、载体的选择与构建二、载体的选择与构建88目目的的基基因因与与载载体体连连接接粘性末端匹配粘性末端匹配89三、目的基因与克隆载体的连接三、目的基因与克隆载体的连接同一种限制酶酶切同一种限制酶酶切 ( (一一) )黏性末端连接黏性末端连接缺点：缺点：载体自身环化；载体自身环化；双向插入；双向插入；90碱性磷酸酶防止载体的自身环化碱性磷酸酶防止载体的自身环化 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 质粒质粒
53、 目的基因目的基因 目的基因目的基因和载体连接和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 3 HO-G CTTAA-OH 5 5 HO -AATTC G-OH 3 退火退火 DNADNA连接酶连接酶 3 HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5 OH AATTC G AATTC G-OH 3 91定向克隆定向克隆v使目的基因按正确方向插入载体分子中的方法。使目的基因按正确方向插入载体分子中的方法。 定向克隆的两种连接方式：定向克隆的两种连接方式：粘粘粘粘 连接连接粘平粘平 连接连接92同聚物加尾连接同聚物加尾连接 本法适用于在本法适用于在载体和目的基载体和目的基因上因上没有相
54、同没有相同的限制的限制酶切位点酶切位点93质粒质粒 目的基因目的基因 3 3 3 ACGTC G 5 5 G CTGCA 3 3 GnGGGACGTC G 5 5 G CTGCAGGGGn 3 3 CnCCC 5 5 CCCCn 3 末端转移酶末端转移酶 dGTP 末端转移酶末端转移酶 dCTP 混合，退火混合，退火 1）转化细菌）转化细菌2）体内修复）体内修复同聚尾连接法构建同聚尾连接法构建DNADNA重组体重组体G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶核酸外切酶 目的基因和目的基因和载体连接载体连接GACGT C CTGCA GG ACGTC
55、C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 94本法适用于在本法适用于在载体和目的基载体和目的基因上因上没有相同没有相同的限制酶切位点的限制酶切位点 人工接头（人工接头（linkerlinker）：）： 化学合成的含一种或多种限制酶切位点的化学合成的含一种或多种限制酶切位点的平端双链寡核苷酸片段。平端双链寡核苷酸片段。 PCR扩增扩增95( (二二) ) 平末端连接平末端连接质粒质粒产生产生平末端平末端的的限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶目的基因目的基因目的基因目的基因 产生产生粘性末粘性末端端的的限制酶限制酶产生产生粘性末粘性末端端的的限制酶限制酶核酸酶核酸酶S1S1
56、核酸酶核酸酶S1S1缺点：缺点：效率低；效率低；载体自身环化；载体自身环化；双向插入；双向插入；96对宿主细胞的要求：对宿主细胞的要求： 具有接受外源具有接受外源DNADNA的能力，易于转化；的能力，易于转化； 限制修饰系统缺陷限制修饰系统缺陷; ; 重组系统缺陷重组系统缺陷; ; 遗传表型具有互补性遗传表型具有互补性; ; 感感染染寄寄生生缺缺陷陷 （安安全全性）性）; ;四、重组四、重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞97受体细胞受体细胞( (宿主细胞宿主细胞) )分两大类分两大类 ： 原核细胞原核细胞: :大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌等；枯草杆菌等； 真核细胞真核细胞: :酵母、昆虫、
57、酵母、昆虫、哺乳动物细胞哺乳动物细胞等等 四、重组四、重组DNADNA的导入的导入- -转转重组重组DNADNA的克隆和表达必须借助的克隆和表达必须借助受体细胞（宿主细胞）受体细胞（宿主细胞）98 （一）重组（一）重组DNADNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌 CaClCaCl2 2转化法转化法 电穿孔转化法电穿孔转化法 体外包装感染法体外包装感染法 感受态感受态 (competent)(competent) 容易吸收外源容易吸收外源DNADNA的状态的状态（细胞膜结构改变、通（细胞膜结构改变、通透性增加等）透性增加等）。 99磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 病毒感染法病毒感染法 脂质体介导法脂质体介导法
58、 显微注射法显微注射法 （二）重组（二）重组DNADNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞 100 阳性克隆：阳性克隆： 含有目的基因的宿主细胞克隆。含有目的基因的宿主细胞克隆。阳性克隆的筛选步骤阳性克隆的筛选步骤: : 带载体的克隆；带载体的克隆； 带重组体的克隆；带重组体的克隆； 带特异目的基因的克隆；带特异目的基因的克隆； 五、重组体的筛选和鉴定五、重组体的筛选和鉴定101针对载体针对载体（一（一）根据遗传表型进行筛选）根据遗传表型进行筛选 抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选 遗传标记补救筛选遗传标记补救筛选 噬菌斑筛选噬菌斑筛选 阳性克隆的筛选方法阳性克隆的筛选方法102抗生素抗性标记筛选抗生
59、素抗性标记筛选103双抗生素对照筛选双抗生素对照筛选筛选重组体筛选重组体104遗传标记补救筛选遗传标记补救筛选 蓝白斑蓝白斑 105噬菌斑筛选法噬菌斑筛选法 噬菌体载体噬菌体载体 重组噬菌体重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体分子量大小的分子量大小的75%75%105%105%之间。之间。106 限制酶谱分析限制酶谱分析 核酸核酸杂交法杂交法 PCRPCR扩增扩增 序列测定序列测定针对重组体结构筛选针对重组体结构筛选目的目的DNADNA序列序列 免疫分析筛选免疫分析筛选表达蛋白质表达蛋白质107序列序列分析分析PCR限制酶谱分析限制酶谱分析108核酸分子杂交核酸分子杂
60、交 Western blot 1 2 3 4109第五节第五节 克隆基因的表达和分离纯化克隆基因的表达和分离纯化v外源基因（主要真核基因）在原核细胞中的表达外源基因（主要真核基因）在原核细胞中的表达 原核生物基因表达具有以下特点：原核生物基因表达具有以下特点： 只有一种只有一种RNA聚合酶；聚合酶； 表达调控主要在转录水平，操纵子表达调控主要在转录水平，操纵子 ； 转录和翻译是偶联、连续进行的；转录和翻译是偶联、连续进行的； 原核基因一般无内含子，缺乏真核转录后加工系统；原核基因一般无内含子，缺乏真核转录后加工系统； 核糖体结合位点核糖体结合位点SD序列；序列； 110如何提高外源基因在原核系统中的表达如何提高外源基因在原核系统中的表达? 转录水平转录水平 翻译水平翻译水平 诱导表达？诱导表达？ 提高表达蛋白的稳定性提高表达蛋白的稳定性?111克隆基因在真核细胞中的表达克隆基因在真核细胞中的表达 酵母表达系统酵母表达系统 哺乳动物表达系统哺乳动物表达系统 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 112
